胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究

北京理工大学珠海学院2009届

胰蛋白酶的分离纯化及动力学研究

摘要

通过沉淀离心法提取胰蛋白酶的专一性抑制剂-鸡卵类粘蛋白（CHOM）,作为亲和配基，利用亲和层析法进行分离纯化胰蛋白酶，接着以抑制剂对酶反应速度的影响了解酶促反应，掌握其规律，来最大限度地实现酶促反应的高效率，寻找最有利的反应条件以及了解酶在代谢中的作用，最后SDS-PAGE进行酶纯度检验以及其相对分子量的测定。

关键词：胰蛋白酶鸡卵粘蛋白亲和层析法米氏常数酶促反应动力聚丙烯酰胺凝胶电泳

Trypsin of isolation and purification and dynamic research

ABSTRACT

Through the precipitation centrifugation extraction specificity of trypsin inhibitor - chicken egg kind mucin (CHOM), as affinity ligands, using the method of affinity chromatography separation and purification, and then to by trypsin inhibitor enzyme reaction speed is known about the effects of enzymatic reaction, grasp their rule, come maximally realize enzymatic reaction efficient, find the most favorable reaction conditions and understand the role in metabolic enzymes, finally sds-page for enzyme and its relative molecular weight inspection purity of determination.

目录

摘要 (Ⅰ)

ABSTRACT (Ⅱ)

目录 (Ⅲ)

1 引言 (1)

2 材料与方法 (1)

2.1原料与试剂 (1)

2.2仪器设备 (1)

2.3实验方法 (2)

2.3.1CHOM的分离 (2)

2.3.2CHOM的定量 (2)

2.3.3胰蛋白酶的分离 (2)

2.3.4酶活力的测定 (2)

2.3.5纯化效果及纯化蛋白质相对分子量的测定 (2)

3 结果与讨论 (3)

3.1CHOM的分离和定量 (3)

3.2胰蛋白酶的纯化 (4)

3.3酶活力的测定 (5)

3.4纯化效果及纯化蛋白质分子量的测定 (6)

4总结 (7)

参考文献 (8)

附录 (9)

1 引言

胰蛋白酶是取自猪胰脏的一种蛋白质水解酶，属于丝氨酸蛋白酶家族的消化酶。胰蛋白酶在胰腺中合成并以非活性的酶原形式分泌到消化道中，在消化道中酶原通过除去部分肽链转变成活性酶形式。所以胰蛋白酶不仅是一种重要的消化酶，而且对胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶前体的活性化等其重要作用。胰蛋白酶也是一种重要的工具酶，特别在生物化学、蛋白质组学、细胞生物学、医学等领域中得到了广泛的应用，利用胰蛋白酶可将大分子蛋白质酶解成小分子多肽片段以用于质朴分析、动物细胞培养、制备人胰岛素等。

2 材料与方法

2.1原料与试剂

蛋清制得的CHOM冻存于-4℃冰箱内备用;

澄清金黄色胰脏抽提液（PX），考马斯亮蓝试剂，亲和柱平衡液，亲和柱洗脱液，标准蛋白质溶液，BAEE底物溶液，0.05M，pH8.0Tris-HCl缓冲液，电泳缓冲液

（disc-PAGE,SDS-PAGE）,凝胶加样缓冲液（Loading Buffer）等等。

2.2仪器设备

抽滤装置；移液枪；磁力搅拌器；高速离心机；分光光度计；小型亲和层析柱；蠕动泵；恒温浴水锅；DYY-6C型直流稳压电泳仪；DYCZ-24EN双垂直蛋白电泳槽（北京六一仪器厂）；脱色摇床；凝胶成像系统等。

2.3实验方法

2.3.1CHOM的分离

取蛋清50mL放入一个50mL烧杯中，加入75mLTCA-丙酮，边加边搅拌，立即出现大量白色絮状沉淀，调节pH至3.5左右，继续搅拌15min,然后置于-20℃冰箱放置30min。将溶液装于50mL离心管中，5000rpm、离心5min,取上清液边搅拌边加入2倍体积-20℃预冷丙酮，生成沉淀；在-20℃下静置30min;取下部沉淀6000rpm、离心15min;挖出沉淀溶于10mL纯水，调节pH至4.5，然后再-20℃下对1L纯水进行透析，每1h换一次水。透析后若产生沉淀，6000rpm、离心10min除去，将上清边搅拌边加入4倍体积-20℃预冷丙酮，

产生大量沉淀，在-20℃冰箱放置10min,6000rpm、离心10min,倒弃上清，用预冷丙酮小心洗涤沉淀表面，稍微干燥。加入5mL纯水轻轻震荡溶解，便得到CHOM.

2.3.2CHOM的定量

Bradford法：利用CBG可与蛋白质结合而变色的特性来定量，若样品中蛋白质含量较多，则结合到蛋白质而变色的CBG也多，因而显色较深。实验以一组标准蛋白质为对象，制作一条蛋白质与光吸收值的标准曲线，

来求得样品蛋白质含量。

2.3.3 胰蛋白酶的分离

取2g甲壳素加入2mLCHOM水溶液（8.07mg蛋白含量）和0.25mLCHOM水溶液（173.5mg蛋白含量）混匀，加入1.25mL25%戊二醛，和12.4mL水，室温下反应45min,加入Tris-HCl缓冲液悬浮，装于固定好的并装有1/4体积的亲和柱平衡液的亲和层析柱中，自然沉淀，调节蠕动泵流速2～4mL/10min,不断加入Tris-HCl缓冲液，保持柱内液面高于吸附剂面，收集出口溶液，并用分光光度计测定A280值小于0.01即可。当柱面与床面刚好相切时便上样，调整流速越4s一滴，收集15管流出液4mL/管，经紫外分光光度计测定A280值。再用亲和柱洗脱液进行洗脱，控制流速8s一滴，收集21管流出液2mL/管，考马斯亮蓝法测定每根试管的蛋白含量，保留蛋白含量最高试管的收集液。BAEE法测定胰蛋白酶的酶活力和比活力。

2.3.4 酶活力的测定

以BAEE为底物进行测定，按已下表格依次得出数据，根据每个底物浓度下的△

A253/min,求得酶促反应的初速度v，利用双倒数作图法，以不同浓度的抑制剂下的1/v对1/[S]作图，判断抑制剂类型。

2.3.5 纯化效果及纯化蛋白质分子量的测定

在外场力的作用下，带电的蛋白质分子，将向着与其电荷符号相反的电极移动，该现象称为电泳。目前使用较广泛的凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳用于蛋白质的分离。通过各阶段纯化效果及纯化蛋白分子量用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析,并与相对分子质量标准蛋白质（低）做对照，用考马斯亮蓝R-250染色。

3 结果与讨论

3.1 CHOM的分离和定量