流式细胞术免疫分型在急性髓细胞白血病诊断中的应用何文英

·综述·流式细胞术免疫分型

在急性髓细胞白血病诊断中的应用

江西省抚州市医学科学研究所（344000）何文英

南昌大学第一附属医院彭宽

流在医学研究领域中，流式细胞仪（flow cytometer，FCM）能够快速分析单个细胞的多种特性，它既可以定性也可以定量，适用于大量标本的检测。流式细胞仪可以为全血、骨髓、渗出液、脑脊液、尿液和固体组织等很多的样本进行免疫分型，并可检测细胞大小、胞质内容物、DNA、RNA及大量的膜蛋白和胞内蛋白。临床上采用的急性白血病法，美、英协作组分类标准（FAB）分类方法是基于形态与细胞学检查基础，但这种方法对于来源于同一系列的急性白血病间的鉴别不甚理想，甚至有时对于不同系列的白血病鉴别也较困难[1]。对伴有髓系抗原表达的急性淋巴细胞白血病（ALL）、伴有淋系抗原表达的急性髓细胞白血病（AML）、区分T-ALL和B-ALL、急性混合型以及细胞形态特征不典型的白血病等的诊断也较困难。自从Foon与Todd在1986年提出白血病免疫分型以来，FCM已成为诊断血液系统恶性肿瘤不可缺少的重要工具，广泛应用于白血病的临床检测[2]。其突出的优势是能在分子水平对细胞的理化性质和免疫学特征进行简单、快捷、定性、定量分析，且能够检测残存白血病或标本中幼稚细胞低于50%的白血病[3]。精确的流式细胞仪技术免疫分型通过分析白血病细胞群中特异抗原（CD）的表达特点，不仅能够给诊断提供客观的指标，而且能够根据某些抗原表达的情况来研究疾病的发展和判断预后[4]。以下阐述流式细胞仪技术免疫分型在急性髓细胞白血病诊断中的应用。

1流式细胞仪的工作原理

流式细胞仪的结构一般可分为5个部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测与存储、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。流式细胞仪可以检测单个细胞的可见光和荧光特性。通过检测细胞大小和内容物等物理特性可以对细胞进行分群。荧光染料可以连接或插入到DNA、RNA等细胞内容物中。另外，荧光染料连接的抗体能够与细胞膜上或其内部的特异蛋白结合。当标记细胞通过光源时，荧光分子被激发到较高的能级。当其回到基态后，荧光染料在较长的波长上释放光能。流式细胞仪通常使用激光作为激发光源，激发光向各个方向散射，通过一系列的滤光片和双色性反光镜的分离，形成不同波长的荧光信号。光信号经光电倍增管接收后转换为电信号，经数/模转换器转换为可被计算机识别的数字信号。检测数据可以以直方图和二维散点图表示[5，6]。

FCM白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体（McAb）作为分子探针，多参数分析白血病细胞的抗原表型，由此确定被测白血病细胞所属细胞系列及分化程度。样品需要用活细胞，如果是血液和骨髓，需要把红细胞分离开（氯化氨溶解或密度梯度离心）。现今国际上通用的是CD45/SSC 设门法[7]，即用CD45与侧向角（side scatter，SSC）对数取样后，可将骨髓细胞清晰地分出淋巴细胞、单核细胞、成熟粒细胞、幼稚细胞和红细胞群。其理论依据：CD45是所有白细胞的抗原，其表达量在淋巴细胞最高，单核细胞、成熟粒细胞、早期造血细胞依次减弱，红细胞（中、晚幼红细胞、成熟红细胞）不表达CD45[8]。SSC反映细胞的颗粒性，成熟粒细胞SSC 最高，依次为单核细胞、淋巴细胞、胚胞（blasts）、红细胞。这种方法须采用第三色或第四色荧光标记CD，同时配合两种或三种荧光标记的单克隆抗体，则很容易测出非正常细胞群的抗原表达，同时排除正常细胞的干扰。

2FCM免疫分型在急性髓细胞白血病诊断中的应用AML以前称为急性非淋巴细胞白血病（ANLL），是一种高度异质性的造血系统恶性克隆性疾病，这类白血病细胞的免疫表达种类繁杂，缺乏特异性和敏感性（与ALL相比），其免疫分型如下，见第158页表1。

2.1AML-M0：1987年正式确定的极微分化型AML，以AML-M0来表示，到1991年才通行到全世界。这个类型是免疫标记技术在AML中应用的一个范例。可以这样说，没有免疫标记在白血病分型中的应用，就不可能诊断AML-M0。AML-M0通常是TdT（terminal deoxynucleo，transferase，末端脱氧核苷转移酶）阴性、淋巴抗原阴性和<3%的髓过氧化物酶（MPO）表达，而以CD68、CD13、CD14和CD33中的1个或2个阳性表达为主。其中CD68表达率为45%，CD14为13%，CD33为32%，某一分化抗原单独阳性的为52%，两个分化抗原阳性的占40%左右，两个以上阳性的不超过5%。

2.2AML-M1：由于这类AML存在大量原始阶段的粒细胞，其成熟程度极差，主要是MPO[9]、CD13、CD33、CD68阳性和10%左右的CD14阳性表达。而人类白细胞抗原（HLA）-DR的阳性率也可达30%左右。

2.3AML-M2：在AML中，此型可占1/3以上。CD13、CD33、CD68在AML-M2白血病细胞上的表达率各占1/3。CD4和CD2也可出现伴随阳性，占10%～15%，但CD19和CD34在所有M2型白血病细胞中均为阴性[10，11]。

2.4AML-M3：即急性早幼粒细胞性白血病（APL），目前国内也将过去的M3a、M3b亚型归入相应的国际上通用的M3a和

通信作者：彭宽

M3v亚型。其中CD34、HLA-DR在M3a不表达，而CD2在M3v 不表达。其余免疫表达类似于M2型。即MPO达100%[12]，CD68占90%，CD13和CD33均为85%左右，CD14为14%。2%的M3患者可伴淋巴系抗原，其中M3a以CD2为主，M3v 以CD3为主。

2.5AML-M4：M4均属粒单细胞白血病，但免疫分型有较大差异。M4a、M4b和M4c以CD13、CD68、CD33表达为最高[13]，分别是75%、82%和78%，MPO阳性率可达95%以上。CD14较国外报道低，大约在30%，M4a、M4b和M4c之间无明显差异。但M4EOS则很不一致，以CD13和CD34表达最高，可达80%左右,其他依次为CD11b、CD11c、CD14和CD33。

2.6AML-M5：急性单核细胞白血病占AML的10%左右，无论是M5a还是M5b均以CD68的表达率最高，可达99%以上；其次为MPO，占90%；CD33为60%；CD13为48%；而CD14也只有36%。可见CD14对单核细胞的特异性和敏感性均未达到临床的预值。CD136初步应用结果显示：在M5白血病细胞中的阳性表达可有65%左右，在M4以外的白血病细胞中的阳性率不超过3%，在M4a、M4b和M4c中也可达到50%左右，预示着较好的应用前景。

2.7AML-M6：虽然M6不到AML的5%，但诊断并不容易。除了血型糖蛋白A等几种特殊成分的抗原表达阳性和MPO、CD68、CD41等少数抗原阴性外，其余免疫标记没有特别意义，且与骨髓增生异常综合征（MDS）等克隆性骨髓增生性疾病难以区分。

2.8AML-M7：据国外统计，M7型白血病发病率应该占AML 的10%～15%，但由于诊断困难，国内发病率是较低的。AML-M7无论是小型原始巨核细胞增多型，还是不规则的幼稚巨核细胞增多型，均可表达CD13、CD33和10%左右的CD34。高达80%左右表达率的是特异的CD41、CD42b和CD61。

3结语

AML是成人常见的急性白血病，约占成人白血病的80%左右，占儿童白血病的20%。髓系白血病最常见的抗原是CD13、CD14、CD33、CD15、MPO。其中CD13和CD33表达率最高分别为91.9%和78.4%，被认为是ANLL特异性标志。CD14、CD15可作为与单核系有关的系列相关抗原。MPO为中性粒细胞内嗜苯胺蓝颗粒的主要成分，其蛋白于早幼粒阶段开始合成,MPO是髓系特异性标志。CD34、HLA-DR均为干祖细胞相关抗原，也为系列非特异性标志。由于白血病的异质性,白血病细胞常有膜表面系列抗原交叉表达的现象，当膜抗原检测难以确定类型时，细胞质抗原测定起着重要作用。CD7是Ly+AML型中的最常见的淋系抗原。

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（收稿日期：2012-09-26）

表1急性髓细胞白血病部分表达标记物

病名英文缩写表面标记物阳性阴性

急性髓细胞白血病微分化型M0CD13、CD14、CD33或CD34MPO

急性粒细胞白血病未分化型M1CD13、CD33、CD34、HLA-DR、MPO

急性粒细胞白血病部分分化型M2CD13、CD33、CD11、CD15、HLA-DR、MPO

急性早幼粒细胞白血病M3CD13、CD33、CD11、CD15、MPO HLA-DR、CD14急性粒-单核细胞白血病M4CD13、CD15、CD33、CD4、CD11c、CD14

急性单核细胞白血病M5CD13、CD15、CD33、CD4、CD11c、CD14、CD64、HLA-DR、MPO

急性红白血病M6血型糖蛋白

急性巨核细胞白血病M7CD36、CD9、CD41、PPO