蚓激酶研究和应用进展
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梁国栋等[7,8]克隆到2个蚯蚓纤溶酶基因,其中PI239编 码283个氨基酸前体,成熟肽含有239个氨基酸,与国外从 粉正蚓属蚯蚓中获得的纤溶酶基因有很高的同源性,属 酸性蛋白质、丝氨酸蛋白酶,与人凝血酶、t-PA和尿型 纤溶酶原激活物(u-PA)有一定结构同源性。
另一个基因为PI242,是新发现的基因,2001年向 GenBank投送了与F-Ⅲ同源性相近的组分 PI239(GenBank,AF433650),并向中国国家知识产权局
英国学者Sturzenbaum在1997年1月向Genbank投送了 与上述序列同源性很高的一个来源于双胸蚓的蚯蚓胰 凝乳蛋白酶的mRNA序列(Genbank,AJ223152),但是没 有发表相关文献。
根据序列比较和同源性分析结果,同种组分日本和韩国 学者研究结果存在差异,可能因为不同地域的蚯蚓基因 发生不同的进化所造成的。这些序列的报道给蚓激酶 更为具体的鉴定提供了可能。
13来源于双胸蚓(Lumbricus bimastus)的蚓激酶
牛勃等[5]经分离纯化获得了一个相对分子质量为 22·1×103的单一蛋白酶组分。梁国栋等测定了一种来 源于双胸蚓蚯蚓纤溶酶的mRNA序列 (Genbank,AF109648),其编码的成熟肽序列N端与F-Ⅱ 一致,但与F-Ⅲ-1和F-Ⅲ-2的序列同源性仅35%左右。
申报了名为《正蚓科双胸蚓属蚓激酶基因核苷酸序列 及其克隆方法》的发明专利(公开号:CN 1208770A)。
赵晓瑜等于2001年11月报道了来源于赤子爱胜蚓 (Eiseniafetida)中的一个纤溶组分的共180个氨基酸残 基的氨基酸序列(GenBank,AF432224—1)。较早的相关 序列报道还有韩国Choi在1995年4月向Genbank投送了 与日本的F-Ⅲ-1和F-Ⅲ-2相应的来源于双胸蚓的2种蚓 激酶的mRNA序列(Genbank,U25648,U25643),但至今 没有发表相关的文献;
其中EFE水解纤维蛋白的活性较强,适用于防治血栓及栓塞 性疾病。因此EFE的分离纯化、理化性质、作用机制及临 床应用受到国内外广泛的重视。
1 蚓激酶的分离纯化
1·1 来源于粉正蚓(Lumbricus rubullus)的纤溶酶 通过层析、电泳、质谱等对氨基酸组成、N-末端序
列等方面的研究,Nakajima等确定了来源于粉正蚓的 EFE含有6个丝氨酸蛋白酶组分:F-I-0,F-I-1,F-I-2,F-Ⅱ,FⅢ-1,F-Ⅲ-2,并测定它们的N端序列,见表1。
梁国栋等则将从我国特有的双胸蚓属 (Lumbricusbimastus)中获得的蚓激酶新基因 PV242,PI239分别在大肠杆菌和杆状病毒中进行了表达。 这些工作为蚓激酶的进一步分子生物学研究和基因工 程开发奠定了基础。
在蚓激酶基因重组和表达方面,Nakajima等报道了来源 于粉正蚓的蚯蚓纤溶组分F-Ⅲ-2基因的克隆和表达。
中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验 室刘俊峰等[9]用逆转录PCR的方法从赤子爱胜蚓中克 隆了编码蚓激酶组分A的cDNA,导入大肠杆菌的表达 载体pQE31和pMAL- c2X构建了相应的表达质粒,并分 别在大肠杆菌菌株M15中诱导表达出了重组蛋白,一种 以包涵体形式存在,而另一种是具有纤溶活性的可溶性 蛋白。
早在1596年我国《本草纲目》对蚯蚓的药用就
有详细记载。1878年法国人发现蚯蚓消化器官的分
泌物能降解纤维蛋白。20世纪70年代以来,中国、
日本和韩国的科学家对蚯蚓提取物进行了酶学组分、
理化性质及临床应用的研究。1979年Pak发现蚯蚓
提取物中含有能降解酪蛋白、明胶和清蛋白的水解
酶
。
1983年Mihara等从粉正蚓(Lumbricus rubullus)中分离出 具有溶纤活力的粗提物,并将其命名为蚓激酶 (lumbrokinase)。随后,蚯蚓纤维蛋白水解酶(earthworm fibrinolytic enzymes,EFE)、丝氨酸内切蛋白酶、蚯蚓磷 脂激酶等相继被分离出来。
14蚓激酶的序列测定和基因组结 构及重组研究
日本学者Nakajima等[6]报道了来源于粉正蚓中的具纤 溶活性的丝氨酸蛋白酶组分F-Ⅲ-1, F-Ⅲ-2的mRNA的 序列测定结果(GenBank, AB045719,AB045720), F-Ⅲ-1 和F-Ⅲ-2的同源性达到90%左右,但是为确切不同的2种 蛋白质。
中国科学院生物物理研究所蚓激酶研究小组从事该领 域研究已经有十几年的时间,最近他们将来自赤子爱胜 蚓的蚓激酶组分A(EFEa)培养出了单晶,并用X-射线衍 射分析其晶系,测定晶胞参数,收集完整的分辨率数据, 测定氨基酸序列,构建完整的结构模型,并提出与底物结 合、剪切机制。
EFEa是第一个被确定三维晶体结构的蚓激酶组分,也是 第一个来源于环节动物的丝氨酸蛋白酶的晶体结构。 序列比较显示EFEa与F-Ⅱ基本一致。
北京百奥药业公司最近也分离出蚓激酶单一组分,体外 溶栓试验和毒性试验均显示好结果,目前尚无进一步 的报道。
李莉[4]采用琼脂糖凝胶-间氨基苯硼酸亲和层析法从 蚯蚓的匀浆中分离纯化出一糖基化组分,经SDS-PAGE 检测为单一成分,质谱测定其相对分子质量为24 193。 N-末端的序列为:Ala-Glu-Val-Cys-Cys-Asp-Ile-,与已知 的纤溶酶都不同。该糖基化组分对纤维蛋白和蛋白酶 底物Chromozym TH具有显著的水解活性。
1·2来源于赤子爱胜蚓(Eiseniafetida) 的纤溶酶
周元聪等发现赤子爱胜蚓提取物中至少含有7组具有溶 解纤维蛋白活性的组分。经FPLC分离,得到3种纯的纤 溶酶,其中1种同工酶N末端是亮氨酸底物专一性研究结 果显示,该酶的专一性不同于尿激酶而与组织型纤溶酶 原激活物相似。
嘉树等报道了来源于赤子爱胜蚓的相对分子质量为 45×103的EFE由2个片断组成(26×103和18×103),其中大 片段有催化活性,其N端序列与日本报道F-Ⅲ-1(或F-Ⅲ2)和F-Ⅱ的相似。
另一个基因为PI242,是新发现的基因,2001年向 GenBank投送了与F-Ⅲ同源性相近的组分 PI239(GenBank,AF433650),并向中国国家知识产权局
英国学者Sturzenbaum在1997年1月向Genbank投送了 与上述序列同源性很高的一个来源于双胸蚓的蚯蚓胰 凝乳蛋白酶的mRNA序列(Genbank,AJ223152),但是没 有发表相关文献。
根据序列比较和同源性分析结果,同种组分日本和韩国 学者研究结果存在差异,可能因为不同地域的蚯蚓基因 发生不同的进化所造成的。这些序列的报道给蚓激酶 更为具体的鉴定提供了可能。
13来源于双胸蚓(Lumbricus bimastus)的蚓激酶
牛勃等[5]经分离纯化获得了一个相对分子质量为 22·1×103的单一蛋白酶组分。梁国栋等测定了一种来 源于双胸蚓蚯蚓纤溶酶的mRNA序列 (Genbank,AF109648),其编码的成熟肽序列N端与F-Ⅱ 一致,但与F-Ⅲ-1和F-Ⅲ-2的序列同源性仅35%左右。
申报了名为《正蚓科双胸蚓属蚓激酶基因核苷酸序列 及其克隆方法》的发明专利(公开号:CN 1208770A)。
赵晓瑜等于2001年11月报道了来源于赤子爱胜蚓 (Eiseniafetida)中的一个纤溶组分的共180个氨基酸残 基的氨基酸序列(GenBank,AF432224—1)。较早的相关 序列报道还有韩国Choi在1995年4月向Genbank投送了 与日本的F-Ⅲ-1和F-Ⅲ-2相应的来源于双胸蚓的2种蚓 激酶的mRNA序列(Genbank,U25648,U25643),但至今 没有发表相关的文献;
其中EFE水解纤维蛋白的活性较强,适用于防治血栓及栓塞 性疾病。因此EFE的分离纯化、理化性质、作用机制及临 床应用受到国内外广泛的重视。
1 蚓激酶的分离纯化
1·1 来源于粉正蚓(Lumbricus rubullus)的纤溶酶 通过层析、电泳、质谱等对氨基酸组成、N-末端序
列等方面的研究,Nakajima等确定了来源于粉正蚓的 EFE含有6个丝氨酸蛋白酶组分:F-I-0,F-I-1,F-I-2,F-Ⅱ,FⅢ-1,F-Ⅲ-2,并测定它们的N端序列,见表1。
梁国栋等则将从我国特有的双胸蚓属 (Lumbricusbimastus)中获得的蚓激酶新基因 PV242,PI239分别在大肠杆菌和杆状病毒中进行了表达。 这些工作为蚓激酶的进一步分子生物学研究和基因工 程开发奠定了基础。
在蚓激酶基因重组和表达方面,Nakajima等报道了来源 于粉正蚓的蚯蚓纤溶组分F-Ⅲ-2基因的克隆和表达。
中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验 室刘俊峰等[9]用逆转录PCR的方法从赤子爱胜蚓中克 隆了编码蚓激酶组分A的cDNA,导入大肠杆菌的表达 载体pQE31和pMAL- c2X构建了相应的表达质粒,并分 别在大肠杆菌菌株M15中诱导表达出了重组蛋白,一种 以包涵体形式存在,而另一种是具有纤溶活性的可溶性 蛋白。
早在1596年我国《本草纲目》对蚯蚓的药用就
有详细记载。1878年法国人发现蚯蚓消化器官的分
泌物能降解纤维蛋白。20世纪70年代以来,中国、
日本和韩国的科学家对蚯蚓提取物进行了酶学组分、
理化性质及临床应用的研究。1979年Pak发现蚯蚓
提取物中含有能降解酪蛋白、明胶和清蛋白的水解
酶
。
1983年Mihara等从粉正蚓(Lumbricus rubullus)中分离出 具有溶纤活力的粗提物,并将其命名为蚓激酶 (lumbrokinase)。随后,蚯蚓纤维蛋白水解酶(earthworm fibrinolytic enzymes,EFE)、丝氨酸内切蛋白酶、蚯蚓磷 脂激酶等相继被分离出来。
14蚓激酶的序列测定和基因组结 构及重组研究
日本学者Nakajima等[6]报道了来源于粉正蚓中的具纤 溶活性的丝氨酸蛋白酶组分F-Ⅲ-1, F-Ⅲ-2的mRNA的 序列测定结果(GenBank, AB045719,AB045720), F-Ⅲ-1 和F-Ⅲ-2的同源性达到90%左右,但是为确切不同的2种 蛋白质。
中国科学院生物物理研究所蚓激酶研究小组从事该领 域研究已经有十几年的时间,最近他们将来自赤子爱胜 蚓的蚓激酶组分A(EFEa)培养出了单晶,并用X-射线衍 射分析其晶系,测定晶胞参数,收集完整的分辨率数据, 测定氨基酸序列,构建完整的结构模型,并提出与底物结 合、剪切机制。
EFEa是第一个被确定三维晶体结构的蚓激酶组分,也是 第一个来源于环节动物的丝氨酸蛋白酶的晶体结构。 序列比较显示EFEa与F-Ⅱ基本一致。
北京百奥药业公司最近也分离出蚓激酶单一组分,体外 溶栓试验和毒性试验均显示好结果,目前尚无进一步 的报道。
李莉[4]采用琼脂糖凝胶-间氨基苯硼酸亲和层析法从 蚯蚓的匀浆中分离纯化出一糖基化组分,经SDS-PAGE 检测为单一成分,质谱测定其相对分子质量为24 193。 N-末端的序列为:Ala-Glu-Val-Cys-Cys-Asp-Ile-,与已知 的纤溶酶都不同。该糖基化组分对纤维蛋白和蛋白酶 底物Chromozym TH具有显著的水解活性。
1·2来源于赤子爱胜蚓(Eiseniafetida) 的纤溶酶
周元聪等发现赤子爱胜蚓提取物中至少含有7组具有溶 解纤维蛋白活性的组分。经FPLC分离,得到3种纯的纤 溶酶,其中1种同工酶N末端是亮氨酸底物专一性研究结 果显示,该酶的专一性不同于尿激酶而与组织型纤溶酶 原激活物相似。
嘉树等报道了来源于赤子爱胜蚓的相对分子质量为 45×103的EFE由2个片断组成(26×103和18×103),其中大 片段有催化活性,其N端序列与日本报道F-Ⅲ-1(或F-Ⅲ2)和F-Ⅱ的相似。