病原微生物检测方法
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PCR-EL ISA 法是PCR 与EL ISA 技术结合的检测 方法。其综合了PCR 、分子杂交和EL ISA 3种 技术的优点。主要用于检测样品中的特定基因。 它引入地高辛(或生物素) 标记的dN TP 或引物 进行PCR 扩增,利用酶标抗地高辛抗体(或酶标 记亲和素) 进行EL ISA 检测,代替了用于常规 PCR 产物检测的电泳方法,方便快捷,易于处理 大量样品,且其灵敏度比使用琼脂糖凝胶电泳 检测方法高100倍,当有适当的标准品时,还可 进行定量测定。
15
斑点杂交
点样 DNA/RNA 样品 Probe-32P 放射自显 影检测
A B 1 2 3 4
16
SOUTHERN BLOT
17
PCR及其衍生技术
PCR 技术又称体外扩增技术,具有高度的灵敏 性和良好的特异性。。各种衍生技术如反转录 PCR ( RT-PCR) 、多重PCR 、巢式PCR 、PCR 单链构象多态性( PCR-SSCP ) 、RFL P 、RAPD 技术、荧光定量PCR 等。以PCR 为基础的DNA 测序分析可用于病原菌的鉴定和亚型的区分, 以及同种病原菌不同菌株的区分。
24
免疫PCR
该技术把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链 反应的高敏感性有机结合起来,它的基本原理 是用一段已知DNA 分子标记抗体作为探针,用 此探针与待测抗原反应, PCR 扩增粘附在抗原 抗体复合物上的这段DNA 分子,电泳定性,根据 特异性PCR 产物的有无,来判断待测抗原是否 存在。
技术是将生物大分子,如寡核苷酸 cDNA、基因组DNA、肽、抗原以及抗体等固 定在诸如硅片、玻璃片、塑料片、凝胶和尼龙 膜等固相介质上形成生物分子点阵,当待测样 品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生杂 交或相互作用后,利用激光共聚焦显微扫描仪 对杂交信号进行检测和分析。 根据芯片上探针的分子种类而将之分为：DNA 芯片(即基因芯片) 和蛋白质芯片。
病原微生物检测方法
一，生物化学方法
原理：生化方法检测病原微生物实际上是测定微生 物特异性酶。由于各种微生物所具有的系统不完全 相同 ,对许多物质的分解能力亦不一致。因此可利用 不同底物产生的不同代谢产物来间接检测该微生物 内酶的有无 ,从而达到检测特定微生物的目的。 辛酯酶法：快速检测沙门氏菌。沙门氏菌能产生辛 酯酶,这一性能是除沙门氏菌外的各属肠杆菌科细菌 所不具备的。以4-甲基伞形酮辛酯(MUCAP)为底物, 经沙门氏菌的辛酯酶降解后,释放出4-甲基伞形酮 (4MU),在紫外灯下观察其发出的蓝色荧光。
20
PCR扩增程序图
21
2.检测乙肝CCCDNA的PCR法
原理：乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(hepatitis B virus covalently closed circular DNA， HBVcccDNA)是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)复制的中间体，是HBV mRNA和前基因组 RNA合成的模板。细胞外乙型肝炎病毒DNA是一 种松弛环状的双链DNA(relaxed circular DNA， rcDNA)分子，其两条链均不闭合，其中负链较长， 约3200个碱基，含有乙肝病毒基因组的全长基因， 在其5’起始端与3’末端之间有一个包含数个碱基 的“缺刻”(nick)；正链较短，有较大的“缺 口”(gap)，其3’末端不固定，故长度是可变的。
12
检测灰飞虱带RBSDV的DIBA法
1,NC膜用铅笔画出0.5cm正方格 2,单头灰飞虱加100ul碳酸盐缓冲 液，用牙签捣碎，取上清2ul加样， 室温晾干
4,取出NC膜，浸入用封闭液稀释 10000倍的单抗体中，37 ℃,1.5h
3,将干燥的NC膜浸入封闭液中， 37 ℃,30min
5,取出膜，用0.01MPBST洗3次，每次 5min
14
斑点杂交
被广泛用于检测植物或介体带毒及核酸同源性。如 果用于检测RNA样品，称为Northern杂交；如果用于 检测DNA样品，称为Southern杂交。操作程序如下： 1,从病株材料中提取少量汁液。如果病毒核酸为双链， 通过加热使其变性。 2,点样。将病株汁液滴在NC膜上或尼龙膜上。 3,烘烤纤维素膜，使核酸牢固地结合到纤维膜上。 4,用蛋白和非特异性小分子DNA溶液混合进行预杂交约 2小时，封闭膜上的非特异性位点。 5,用标记的核酸探针与膜上样品在封闭塑料袋中进行杂 交过夜，水浴65℃。洗膜后进行放射自显影分析。
23
基于16S RRNA的检测技术
16SrRNA 存在于所有原核生物细胞中,它们相 对稳定且有较高的拷贝数(每个细胞几千个拷 贝) ,其序列中含可变区及高度保守区,因此可设 计群、属、种特异性的探针。现阶段各种常见 细菌的16S rRNA 基因几乎全部测序完成,16S rRNA 编码基因的这些特点使之成为较理想的 细菌基因分类的靶序列。
2
二，血清免疫学方法
免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应,观察和研究 组织细胞、特定抗原(抗体)的定性和定量技术。为了 显示和观察这种抗原抗体反应,需要预先将某种标记 物结合到抗体上,借标记物的荧光或酶的有色反应、 放射性或高电子密度,在光镜或电镜下进行定性、定 位或定量研究。 荧光抗体技术 酶联免疫技术
19
1.检测单头蚜虫带(BYDV-GPV)的PCR法
3,PCR。 10ul cDNA中加入5ul 10X PCR缓冲液，2ul 50mM MgCl2 ，0.15ul引物(1)， 0.15ul引物(2)， 2ul 10mM dNTPs，0.5ul Taq聚合酶，加水至20ul。在PCR仪中进行 35个94℃ (45s)- 50℃(30s) - 72℃(2min)扩增循环，程序结 束后，调至72℃保持10min，在-20℃保存扩增产物。 4,扩增产物的电泳分析。取10ulPCR产物在1﹪琼脂糖凝 胶中电泳，0.1﹪EB染色20min，紫外线下检测，拍照。
5
五，用生物传感器进行病原微生物的鉴定
生物传感器是将新兴的传感器技术和分子诊断 技术相结合而成的一种新技术。生物传感器包 含两部分,即分子识别器件和换能器。 利用大肠杆菌抗体的免疫吸附反应,使用集成 化SPR 传感器快速检测大肠杆菌O157 : H7 ,采 SPR O157 , 用亲和素- 生物素系统放大检测的反应信号,并 引入复合抗体作为二次抗体,使该传感器对大 肠杆菌的检测限由106 cfu/ ml 下降到105 cfu/ ml。
6,将膜浸入用封闭液稀释5000倍 的酶标二抗中， 37 ℃,1.5h
8,将膜浸入HRP底物显色液中， 37 ℃,30min，显色后，用自来水冲洗， 室温晾干
7,取出膜，用0.01MPBST洗3次， 每次5min
13
核酸杂交法
原理：是通过标记根据病原体核酸片段制备的 探针，与病原体核酸片段杂交,观察是否产生 特异的杂交信号。核酸杂交有原位杂交、打点 杂交、斑点杂交、Southern 杂交、Northern 杂交等。核酸分子探针又可根据它们的来源和 性质分为DNA 探针、cDNA 探针、RNA 探针及 人工合成的寡聚核苷酸探针等。
7
七，蛋白质指纹图谱技术
蛋白质指纹图谱技术用于各种疾病特异性蛋白指 纹的识别和判断,可以直接检测不经处理的尿液、 血液或细胞裂解液等。人体血清里有成千上万个 蛋白,人一旦发生了某种疾病,蛋白质成分就必然 会起变化。 可以分析得出SARS与非SARS 病人血清中的蛋白 质成分变化。该技术不是利用单独的蛋白质峰的 出现和消失来判断SARS ,而是用5 个蛋白质峰的 出现和消失来判断,好比刑侦破案中甄别5 个手指 的指纹,故此称为“指纹图谱”。
9
荧光抗体技术
荧光抗体技术是根据抗原抗体反应具有高度的 特异性,把荧光素作为抗原标记物,在荧光显微 镜下检查呈现荧光的特异性抗原抗体复合物及 其存在部位。 直接法是在检测样品上直接滴加已知特异性荧 光标记的抗血清,经洗涤后在荧光显微镜下观 察结果。间接法是在检测样品上滴加已知的细 菌特异性抗体,待作用后经洗涤,再加入荧光标 记的第二抗体。
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18
1.检测单头蚜虫带(BYDV-GPV)的PCR法
1,病毒核酸样品制备。取单头饲毒(GPV)的禾谷缢管蚜 加10ulTris-HCl(pH7.4)研磨，加入10ul苯酚和10ul氯仿， 再次研磨，12000rpm离心2min,得到约10ul上清液。 2,cDNA合成。取1ul上清液(含GPV)依次加入1ulGPV CP 序列引物(1)，2ul 5X MMLV缓冲液， 6ul双蒸水，混匀， 进行80 ℃1min和50 ℃5min反应。再加入2ul 10mM dNTPs, 1ul RNase，1ul 100mM DTT， 1.3ul 50mM MgCl2， 2.1ul MMLV.R.Tase，加双蒸水至反应体系为20ul，进行 37℃30min和100 ℃1min反应，即得到cDNA。
8
八，LAMP技术
环介导等温扩增(loop—mediated isothermal amplification，LAMP)技术是近年来发展出的一种 敏感、特异、方便快捷的核酸扩增技术。与传统 PCR方法相比，LAMP不需要热循环，为等温扩增。 且由于LAMP反应中产生大量的副产物一白色焦磷 酸钾沉淀，扩增产物可不经过电泳，通过肉眼观 察或浊度计即可判定结果。 用于检测：丙型肝炎病毒(HCV) 、严重急性呼吸 综合征冠状病毒(SARS—CoV) 、乙脑病毒(JEV) 、 甲型流感病毒(AIV) 、 腮腺炎病毒(MV)等。
22
嵌合引物荧光PCR法
Jun—Bin S等在利用Taqman探针进行的荧光定量PCR检 测中设计了一条特殊的嵌合引物。该引物由两个片段 连接而成，3’端是与HBV DNA正链DR2区前的序列互补 的A片段，5’端的B片段是与HBV基因组没有同源性的 HBV基因组的部分序列。cccDNA因为正链完整，引物 与正链的特定区域杂交后，在DNA聚合酶的作用下， 引物能够顺利延伸形成一条新生链，而HBV DNA的其 他形式，如rcDNA，引物的延伸停止于DR2区。新生链 形成以后，设计另一对引物，一个与嵌合性引物的片 段B杂交，另一个与正链DR2后的序列互补，进行PCR 扩增。实时PCR仪通过探针释放的荧光强度进行 cccDNA定量。
11
酶联免疫技术
酶联免疫技术是根据抗原- 抗体的免疫反应与酶 的高效催化作用原理有机结合,通过酶催化底物进 而发生一系列的化学反应,使溶液呈现出颜色变化, 从而显示抗原抗体特异性反应的存在。 Dot-ELISA法（DIBA法）： Dot-ELISA 以纤维素膜 代替常规ELISA 中常用的聚苯乙烯酶标板，这种 微孔滤膜对样品吸附量大，且包被牢固，所以样 品用量少，试验结果可通过颜色斑点的出现与否 和色泽进行判定，不需特殊仪器。 。
3
三，分子生物学方法
分子生物学及分子遗传学的发展 ,使人们对微生物的 认识逐渐从外部结构特征转向内部基因结构特征 ,微 生物的检测也相应的从生化、免疫方法转向基因水 平的检测。 核酸杂交法 PCR及其衍生技术 基于16S rRNA的检测技术
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四，分子生物学与免疫学相结合的方法
免疫 PCR (immuno polymerase chain reaction , IM PCR) PCR-ELISA
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斑点杂交
点样 DNA/RNA 样品 Probe-32P 放射自显 影检测
A B 1 2 3 4
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SOUTHERN BLOT
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PCR及其衍生技术
PCR 技术又称体外扩增技术,具有高度的灵敏 性和良好的特异性。。各种衍生技术如反转录 PCR ( RT-PCR) 、多重PCR 、巢式PCR 、PCR 单链构象多态性( PCR-SSCP ) 、RFL P 、RAPD 技术、荧光定量PCR 等。以PCR 为基础的DNA 测序分析可用于病原菌的鉴定和亚型的区分, 以及同种病原菌不同菌株的区分。
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免疫PCR
该技术把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链 反应的高敏感性有机结合起来,它的基本原理 是用一段已知DNA 分子标记抗体作为探针,用 此探针与待测抗原反应, PCR 扩增粘附在抗原 抗体复合物上的这段DNA 分子,电泳定性,根据 特异性PCR 产物的有无,来判断待测抗原是否 存在。
技术是将生物大分子,如寡核苷酸 cDNA、基因组DNA、肽、抗原以及抗体等固 定在诸如硅片、玻璃片、塑料片、凝胶和尼龙 膜等固相介质上形成生物分子点阵,当待测样 品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生杂 交或相互作用后,利用激光共聚焦显微扫描仪 对杂交信号进行检测和分析。 根据芯片上探针的分子种类而将之分为：DNA 芯片(即基因芯片) 和蛋白质芯片。
病原微生物检测方法
一，生物化学方法
原理：生化方法检测病原微生物实际上是测定微生 物特异性酶。由于各种微生物所具有的系统不完全 相同 ,对许多物质的分解能力亦不一致。因此可利用 不同底物产生的不同代谢产物来间接检测该微生物 内酶的有无 ,从而达到检测特定微生物的目的。 辛酯酶法：快速检测沙门氏菌。沙门氏菌能产生辛 酯酶,这一性能是除沙门氏菌外的各属肠杆菌科细菌 所不具备的。以4-甲基伞形酮辛酯(MUCAP)为底物, 经沙门氏菌的辛酯酶降解后,释放出4-甲基伞形酮 (4MU),在紫外灯下观察其发出的蓝色荧光。
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PCR扩增程序图
21
2.检测乙肝CCCDNA的PCR法
原理：乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(hepatitis B virus covalently closed circular DNA， HBVcccDNA)是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)复制的中间体，是HBV mRNA和前基因组 RNA合成的模板。细胞外乙型肝炎病毒DNA是一 种松弛环状的双链DNA(relaxed circular DNA， rcDNA)分子，其两条链均不闭合，其中负链较长， 约3200个碱基，含有乙肝病毒基因组的全长基因， 在其5’起始端与3’末端之间有一个包含数个碱基 的“缺刻”(nick)；正链较短，有较大的“缺 口”(gap)，其3’末端不固定，故长度是可变的。
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检测灰飞虱带RBSDV的DIBA法
1,NC膜用铅笔画出0.5cm正方格 2,单头灰飞虱加100ul碳酸盐缓冲 液，用牙签捣碎，取上清2ul加样， 室温晾干
4,取出NC膜，浸入用封闭液稀释 10000倍的单抗体中，37 ℃,1.5h
3,将干燥的NC膜浸入封闭液中， 37 ℃,30min
5,取出膜，用0.01MPBST洗3次，每次 5min
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斑点杂交
被广泛用于检测植物或介体带毒及核酸同源性。如 果用于检测RNA样品，称为Northern杂交；如果用于 检测DNA样品，称为Southern杂交。操作程序如下： 1,从病株材料中提取少量汁液。如果病毒核酸为双链， 通过加热使其变性。 2,点样。将病株汁液滴在NC膜上或尼龙膜上。 3,烘烤纤维素膜，使核酸牢固地结合到纤维膜上。 4,用蛋白和非特异性小分子DNA溶液混合进行预杂交约 2小时，封闭膜上的非特异性位点。 5,用标记的核酸探针与膜上样品在封闭塑料袋中进行杂 交过夜，水浴65℃。洗膜后进行放射自显影分析。
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基于16S RRNA的检测技术
16SrRNA 存在于所有原核生物细胞中,它们相 对稳定且有较高的拷贝数(每个细胞几千个拷 贝) ,其序列中含可变区及高度保守区,因此可设 计群、属、种特异性的探针。现阶段各种常见 细菌的16S rRNA 基因几乎全部测序完成,16S rRNA 编码基因的这些特点使之成为较理想的 细菌基因分类的靶序列。
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二，血清免疫学方法
免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应,观察和研究 组织细胞、特定抗原(抗体)的定性和定量技术。为了 显示和观察这种抗原抗体反应,需要预先将某种标记 物结合到抗体上,借标记物的荧光或酶的有色反应、 放射性或高电子密度,在光镜或电镜下进行定性、定 位或定量研究。 荧光抗体技术 酶联免疫技术
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1.检测单头蚜虫带(BYDV-GPV)的PCR法
3,PCR。 10ul cDNA中加入5ul 10X PCR缓冲液，2ul 50mM MgCl2 ，0.15ul引物(1)， 0.15ul引物(2)， 2ul 10mM dNTPs，0.5ul Taq聚合酶，加水至20ul。在PCR仪中进行 35个94℃ (45s)- 50℃(30s) - 72℃(2min)扩增循环，程序结 束后，调至72℃保持10min，在-20℃保存扩增产物。 4,扩增产物的电泳分析。取10ulPCR产物在1﹪琼脂糖凝 胶中电泳，0.1﹪EB染色20min，紫外线下检测，拍照。
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五，用生物传感器进行病原微生物的鉴定
生物传感器是将新兴的传感器技术和分子诊断 技术相结合而成的一种新技术。生物传感器包 含两部分,即分子识别器件和换能器。 利用大肠杆菌抗体的免疫吸附反应,使用集成 化SPR 传感器快速检测大肠杆菌O157 : H7 ,采 SPR O157 , 用亲和素- 生物素系统放大检测的反应信号,并 引入复合抗体作为二次抗体,使该传感器对大 肠杆菌的检测限由106 cfu/ ml 下降到105 cfu/ ml。
6,将膜浸入用封闭液稀释5000倍 的酶标二抗中， 37 ℃,1.5h
8,将膜浸入HRP底物显色液中， 37 ℃,30min，显色后，用自来水冲洗， 室温晾干
7,取出膜，用0.01MPBST洗3次， 每次5min
13
核酸杂交法
原理：是通过标记根据病原体核酸片段制备的 探针，与病原体核酸片段杂交,观察是否产生 特异的杂交信号。核酸杂交有原位杂交、打点 杂交、斑点杂交、Southern 杂交、Northern 杂交等。核酸分子探针又可根据它们的来源和 性质分为DNA 探针、cDNA 探针、RNA 探针及 人工合成的寡聚核苷酸探针等。
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七，蛋白质指纹图谱技术
蛋白质指纹图谱技术用于各种疾病特异性蛋白指 纹的识别和判断,可以直接检测不经处理的尿液、 血液或细胞裂解液等。人体血清里有成千上万个 蛋白,人一旦发生了某种疾病,蛋白质成分就必然 会起变化。 可以分析得出SARS与非SARS 病人血清中的蛋白 质成分变化。该技术不是利用单独的蛋白质峰的 出现和消失来判断SARS ,而是用5 个蛋白质峰的 出现和消失来判断,好比刑侦破案中甄别5 个手指 的指纹,故此称为“指纹图谱”。
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荧光抗体技术
荧光抗体技术是根据抗原抗体反应具有高度的 特异性,把荧光素作为抗原标记物,在荧光显微 镜下检查呈现荧光的特异性抗原抗体复合物及 其存在部位。 直接法是在检测样品上直接滴加已知特异性荧 光标记的抗血清,经洗涤后在荧光显微镜下观 察结果。间接法是在检测样品上滴加已知的细 菌特异性抗体,待作用后经洗涤,再加入荧光标 记的第二抗体。
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1.检测单头蚜虫带(BYDV-GPV)的PCR法
1,病毒核酸样品制备。取单头饲毒(GPV)的禾谷缢管蚜 加10ulTris-HCl(pH7.4)研磨，加入10ul苯酚和10ul氯仿， 再次研磨，12000rpm离心2min,得到约10ul上清液。 2,cDNA合成。取1ul上清液(含GPV)依次加入1ulGPV CP 序列引物(1)，2ul 5X MMLV缓冲液， 6ul双蒸水，混匀， 进行80 ℃1min和50 ℃5min反应。再加入2ul 10mM dNTPs, 1ul RNase，1ul 100mM DTT， 1.3ul 50mM MgCl2， 2.1ul MMLV.R.Tase，加双蒸水至反应体系为20ul，进行 37℃30min和100 ℃1min反应，即得到cDNA。
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八，LAMP技术
环介导等温扩增(loop—mediated isothermal amplification，LAMP)技术是近年来发展出的一种 敏感、特异、方便快捷的核酸扩增技术。与传统 PCR方法相比，LAMP不需要热循环，为等温扩增。 且由于LAMP反应中产生大量的副产物一白色焦磷 酸钾沉淀，扩增产物可不经过电泳，通过肉眼观 察或浊度计即可判定结果。 用于检测：丙型肝炎病毒(HCV) 、严重急性呼吸 综合征冠状病毒(SARS—CoV) 、乙脑病毒(JEV) 、 甲型流感病毒(AIV) 、 腮腺炎病毒(MV)等。
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嵌合引物荧光PCR法
Jun—Bin S等在利用Taqman探针进行的荧光定量PCR检 测中设计了一条特殊的嵌合引物。该引物由两个片段 连接而成，3’端是与HBV DNA正链DR2区前的序列互补 的A片段，5’端的B片段是与HBV基因组没有同源性的 HBV基因组的部分序列。cccDNA因为正链完整，引物 与正链的特定区域杂交后，在DNA聚合酶的作用下， 引物能够顺利延伸形成一条新生链，而HBV DNA的其 他形式，如rcDNA，引物的延伸停止于DR2区。新生链 形成以后，设计另一对引物，一个与嵌合性引物的片 段B杂交，另一个与正链DR2后的序列互补，进行PCR 扩增。实时PCR仪通过探针释放的荧光强度进行 cccDNA定量。
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酶联免疫技术
酶联免疫技术是根据抗原- 抗体的免疫反应与酶 的高效催化作用原理有机结合,通过酶催化底物进 而发生一系列的化学反应,使溶液呈现出颜色变化, 从而显示抗原抗体特异性反应的存在。 Dot-ELISA法（DIBA法）： Dot-ELISA 以纤维素膜 代替常规ELISA 中常用的聚苯乙烯酶标板，这种 微孔滤膜对样品吸附量大，且包被牢固，所以样 品用量少，试验结果可通过颜色斑点的出现与否 和色泽进行判定，不需特殊仪器。 。
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三，分子生物学方法
分子生物学及分子遗传学的发展 ,使人们对微生物的 认识逐渐从外部结构特征转向内部基因结构特征 ,微 生物的检测也相应的从生化、免疫方法转向基因水 平的检测。 核酸杂交法 PCR及其衍生技术 基于16S rRNA的检测技术
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四，分子生物学与免疫学相结合的方法
免疫 PCR (immuno polymerase chain reaction , IM PCR) PCR-ELISA