【CN110093451A】用于测定重组人生长激素融合蛋白生物学活性的新方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910282012.0
(22)申请日 2019.04.09
(66)本国优先权数据
201811566087.3 2018.12.20 CN
(71)申请人 中国食品药品检定研究院
地址 100050 北京市东城区天坛西里2号
(72)发明人 饶春明　王军志　姚文荣　范文红　
于雷　秦玺　史新昌　刘兰　
(74)专利代理机构 北京中知法苑知识产权代理
事务所(普通合伙) 11226
代理人 常玉明　张兰海
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6897(2018.01)
C12Q 1/02(2006.01)
C12N 15/85(2006.01)
(54)发明名称
用于测定重组人生长激素融合蛋白生物学
活性的新方法
(57)摘要
本发明涉及荧光素酶报告基因法测定重组
人生长激素Fc融合蛋白的生物学活性。

所述方法
利用STAT5反应元件(SGG1)和GHR 质粒，转染
HEK293细胞后获得稳定表达SGG1荧光素酶报告
基因和GHR的细胞株，加入生长激素Fc融合蛋白
刺激后，激活SGG1反应元件下游荧光素酶报告基
因表达，根据荧光信号值拟合四参数曲线确定生
长激素Fc融合蛋白的生物学活性。

本发明针对生
长激素Fc融合蛋白的生物学活性测定建立了易
于操作、灵敏度高、变异系数小和准确性高的检
测方法，对于生长激素Fc融合蛋白的研发和生产
中的质量控制具有重要的指导作用。

权利要求书1页 说明书5页 附图4页CN 110093451 A 2019.08.06
C N 110093451
A
权　利　要　求　书1/1页CN 110093451 A
1.一种应用荧光素酶报告基因法来快速评价生长激素Fc融合蛋白(GH-Fc)生物学活性的方法，其所述方法基于GH及其受体结合后激活JAK2-STATs信号途径，进而结合STAT5反应元件后激活其下游荧光素酶基因的转录。

2.构建的荧光素酶报告基因细胞株包括获得稳定表达STAT5反应元件和GHR的细胞株，加入的GH-Fc蛋白与转基因细胞表面的GHR受体结合，激活反应元件下游荧光素酶报告基因的表达，根据测得的荧光素酶报告基因信号值拟合四参数曲线确定GH-Fc的生物学活性。

3.根据权利要求1和2的快速测定GH-Fc蛋白生物学活性方法，其特征在于：
(1)构建稳定表达STAT5反应元件(本发明命名为SGG1)和GHR的细胞株用于测定GH-Fc 蛋白的生物学活性；
(2)将GH-Fc蛋白及参比品稀释至预稀释浓度，3倍比稀释，加入至(1)细胞中，37℃，5％CO2作用；
(3)加入荧光素酶底物，根据测得的荧光值拟合四参数曲线，确定GH-Fc蛋白的生物学活性。

4.根据权利要求1-3所述方法，其中稳定表达SGG1和GHR的细胞株选择HEK293细胞和HeLa细胞，优选为稳定表达SGG1和GHR的HEK293细胞。

5.根据权利要求1-3所述方法，其中报告基因为荧光素酶报告基因。

6.根据权利要求1-3的技术方案，其特征在于：
(1)重悬细胞时采用1640培养液；
(2)铺板细胞数量为2.0-5.0×104/孔，优先4.0×104/孔；
(3)GH-Fc融合蛋白及参比品的稀释液为1640培养液；
(4)用稳定表达SGG1和GHR的HEK293细胞检测时，GH-Fc融合蛋白的预稀释浓度为15μg/ mL(15000ng/mL)，3倍比稀释；
(5)加入GH-Fc融合蛋白后，与转基因细胞作用时间为3-6h，优先5h；
(6)检测的是GH-Fc融合蛋白与转基因细胞作用后荧光素酶基因表达的变化；
(7)荧光素酶底物试剂盒有PerkinElmer的Britelite plus和Promega的Bright-Glo，优先PerkinElmer的Britelite plus试剂盒；
(8)酶标仪读取荧光值，通过拟合四参数曲线确定GH-Fc融合蛋白和参比品的EC50值，以相对生物学活性(相对生物学活性＝参比品EC50/样品EC50)反应GH-Fc融合蛋白的生物学活性。

7.权利要求1-6所述方法用于GH-Fc融合蛋白药物生产和研发中的质量控制。

2。