抗原表位

是，但并非经常
是
合成肽库法
否
是
研究方法
5 抗原表位的预测法

从80年代Hopp和Woods提出亲水性参数对抗原表位预测的 方法以来，已有许多参数、算法发表，对B细胞蛋白抗原表 位研究起到巨大的推动作用。现已被大众认可并具有较好预 测效果的方法，主要有以下6种：
抗原表位的预测法

(1)亲水性方案(Hydrophilicity)
在抗原区的频率描述，此频率除以各氨基酸在所有蛋白质中
的频率就可推出此刻度值。

该法研究表明，疏水性氨基酸残基对抗原表位形成亦有贡献。

缺点是其所用的数据库有限，并且连续位点内的残基被认为
是同等重要的。显然那些不重要的残基归入计算会明显降低 相关性。
抗原表位的预测法


(4)可塑性方案(Flexibility)
分类

按表位结构不同，分为连续性抗原表位和不连续性抗原表位。
连续性表位又称线性表位，是由肽链上顺序连续的氨基酸组成 通常这种结合比较弱，因为小肽并不含完整天然蛋白的构象，
在多数情况下这种表位可能只代表了复杂表位的一部分。对其
研究依赖于多肽固相化学合成技术。 后者又称构象型抗原表位，是由那些空间邻近但顺序上不连续 的氨基酸组成。
抗原表位的确立 与选择（一）
报告内容
1
概念
2
研究意义
3
研究方法
抗原表位--定义

抗原表位，又称抗原决定簇(antigenic determinant，AD)，是 指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，因而表位代 表了抗原分子上的一个免疫活性区，负责与抗体分子或免疫 细胞表面的抗原受体结合。严格说来，抗体的特异性是针对 表位而不是针对完整的抗原分子的。 抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面的抗原受体结合， 从而激活淋巴细胞，引起免疫应答；抗原也借表位与相应抗 体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应。 抗原表位的性质、数目和空间构型决定抗原的特异性。



B细胞抗原表位的预测法

(2)可及性方案(Accessibility) 如Janin可及性参数，指蛋白质抗原中氨基酸残基被溶剂分 子接触的可能性。它反映了蛋白质抗原内、外各层残基的分 布情况。

抗原表位的预测法


(3)抗原性方案(Antigenicity)
对20个已研究得很透的蛋白质的69个连续位点的606个氨基 酸统计分析，Welling建立了抗原性刻度。每个氨基酸用出现
用此法检测的抗原表位有人H铁蛋 白、蓝舌病病毒的外壳蛋白VP5等。
研究方法
3 缩氨酸扫描技术 (Peptide Scan technology)
此技术于1992年由R. Frank发展出来，它主要是将涵盖所有 抗原氨基酸序列的缩氨酸合成于固定的表面，并与抗血清标 定，此法可鉴定线性抗原表位。


研究方法


2.2 基因工程法（噬菌体随机肽筛选法）
该法先利用基因克隆技术将合成的 一组寡核苷酸混合物（小肽基因混 合物）克隆至线性噬菌体基因组中， 使之以融合蛋白的形式在噬菌体的 外壳蛋白的氨基端表达。再利用生 物素或酶标记的抗体筛出特异的噬 菌体，并进行扩增，再筛选，从结 合特异抗体的噬菌体DNA序列推断 出氨基酸序列，并合成相应的短肽， 验证筛选结果。
指蛋白抗原构象不是刚性不变的，其多肽链骨架有一定程度
的活动性，活动性强的氨基酸残基即可塑性大的位点，易形 成抗原表位。Karplas 和Schulz基于已知结构的31个蛋白质， 发展了一种预测蛋白质片段活动性的方法。


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(5)电荷分布方案(Charge distribution)
认为对碱性抗原特异的抗体多趋于酸性，对酸性抗原特异的


基被称为免疫显性基团。
抗原表位--分类

覆盖型和非覆盖型表位
某些抗原分子表面，不同表位之间相对分离，各自结合 特异性抗体，互不影响，这类表位被称为非覆盖型表位。 若某一表位与相应抗体结合会影响另一表位与抗体的结合， 此类表位称为覆盖型表位。

功能性和隐蔽表位
位于抗原分子表面的表位易被相应淋巴细胞所识别，即具 有易接近性，可直接启动免疫应答，故称为功能性表位。 存在于抗原分子内部的表位无直接触发免疫应答的功能， 称为隐蔽表位。若通过理化因素处理抗原，使其结构发生改变， 内部的隐蔽表位被暴露，可能成为新的有功能的表位。

研究方法--表位作图
推荐使用表位作图方法和基本条件
方法 构象表位 线性表位 条件 精确度
竞争分析方法
是，但并非经常
是
标记抗体、抗 原 必须克隆， DNA(已知基因 序列) 必须建立肽库
仅确定空间位 置竞争 构象50-200个 氨基酸 线状 10-20个氨基酸 完全绘制3-15
基因片段表达 法
分类
按照与抗原受体细胞结合不同，分为B细胞抗原表位和T细 胞抗原表位。
特性 表位分子 MHC分子 表位性质 表位大小 T细胞表位 TCR 必需 主要是线性多肽 8-12氨基酸(CD8-TC) 12-17氨基酸(CD4-TC) B细胞表位 BCR 无需 天然的多肽、多糖、脂 多糖、有机化合物 5-15个氨基酸，5-7个 单糖或5-7个核苷酸

研究方法


1.2 水解抗原-抗体复合物
这是一个直接的确定线性及构象性抗原表位的方法，又称为Protein footprinting。其理论依据为抗原--抗体复合物的结合部位能抵抗蛋白酶的水 解。 根据蛋白质抗原性质的不同常采用3种方法。 对于蛋白酶水解位点较少的抗原，一般先将抗原与等摩尔抗体在PBS中反 应，然后酶解，SDS-PAGE分离水解产物，分析结果。 对于蛋白酶水解位点较多的抗原，采用HPLC法，将抗原--抗体复合物的酶 解片段和同样条件下的抗原酶解片段分别用HPLC分析。两者图谱对应峰峰 高比大于平均数值的片段则推测为抗原表位。 对于能确定为线性表位的抗原可先将抗体连接于固相载体上，并将此固相 载体装柱，然后让过量的抗原溶液通过此柱，使抗原-抗体形成复合物。一 定条件下，酶溶液过柱，酶解此抗原-抗体复合物，PBS洗去酶解下的不结 合片段，再用1.0mol/L的乙酸洗下与抗体结合的肽段。HPLC分析这些片段 以确定结果。 近来，质谱技术在这类结果分析中得到了广泛的应用。采用该法已成功地 确定了细胞色素C，胃泌素释放肽(GRP)，脂碱性磷酸酶(PLAP)等的抗原 表位。
1.传统化学“切割”法或酶法（classical epitope mapping）

通过化学或生物学方法处理抗原分子以获得多肽碎片，再利用单克 隆抗体筛选能与之起阳性反应的片段。


1.1 用化学法或酶“切割”抗原，分离抗原肽段
该法对蛋白质的一级结构不作要求，但测定结果只能是抗原的线性表位 。 化学切割法中常用的试剂：CNBr，NTCB，IBA，甲醇。 酶法切割常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶和V8 蛋白酶等。


C
抗原分子以其B细胞表位与抗体分子的抗原结合部位发生互补性结合 A.抗原--抗体复合物的立体构象；
B.采用电脑技术将抗原和抗体分子分开，可见抗原和抗体分子的相互作用仅发生 在抗原分子的B细胞表位和抗体分子的抗原结合部位之间，两者呈现结构互补。
C.抗体的互补决定区与抗原表位结合示意图

一般情况下，一个多肽表位含5~6个氨基酸残基；一个多糖 表位含5~7个单糖；一个核酸半抗原的表位含6~8个核苷酸。 抗原表位的大小与相应抗体的抗原结合部位相适合。 一个抗原表位的特异性由组成它的所有残基共同决定，但其 中有些残基在与抗体结合时比其它残基起更大作用，这些残

B 细胞构象表位的预测

以往合成的序列肽仅模拟蛋白质的线性表位，这无疑会遗漏众 多的构象性表位信息。近些年来,随着生物信息学和分子生物学 技术的飞速发展，采用计算机预测和试验相结合的方法进行构 象性表位分析和定位得到了迅速发展，一些可用的基于Web的 预测软件已经公布，如 CEP软件、DiscTope 软件和 MEPS软件。
抗体多趋于碱性。
抗原表位的预测法


(6)二级结构预测方案(Secondary structure) 认为β转角结构为凸出结构，多出现在蛋白质抗原表面，利 于与抗体嵌合，较可能成为抗原表位。而α螺旋、β片层结构 规则不易形变，较难嵌和抗体，一般不作为抗原表位。 可预测蛋白质β转角的有Chou-Fasman，Garnier，Cohen等 方法。其中各种方法预测的成功率均不超过65%。一般认为 Cohen方法对转角的预测正确率很高，对于已知折叠类型的 蛋白质(αα类，ββ类，α/β类)正确率高达95%，对于未知结 构类型的蛋白质，可用3种类型分别预测，3类预测一致的转 角对预测表位有帮助。

抗原表位的预测法

对上述各种参数的预测比较表明，各种方案预测的正确率均 不高。一般将上述多种方案综合考虑，尤以可及性方案、可 塑性方案、抗原性方案及二级结构预测为重要。

已经有一些文献提出了各自不同的综合分析方法。1988年 Jameson和Worf提出一种综合预测方案。权重选择为：40% 来自二级结构成分，可及性、柔韧性各15%，30%来自亲水 性。在吴加金等编的Goldkey软件中，以六种参数HoppWoods，HPLC，Accessibility，Flexibility，Charge， Antigenivity综合考虑，得出综合判断图，阈值以上的峰即认 为是预测的抗原表位。 从软件预测出的抗原表位须用实验来进一步验证。
表位类型
表位位置
线性表位
抗原分子任意部位
构象、线性表位
抗原分子表面
研究意义

表位是蛋白质抗原性的基础 ，研究蛋白质抗原表位 ， 对于设计具有免疫原性和中和活性的多肽、新型 疫苗分子及新型诊断试剂具有较大意义。 应用：多在诊断与疫苗的研究中,尤其是在制作良好 的特异性诊断试剂盒中更为重要。

抗原表位研究方法
研究方法
4 表位作图

早期表位作图或定位(epitopemapping)是基于蛋白质修饰和 降解的原理，可经侧链化学修饰法选择性地标记氨基酸，失 去结合的部分将被测出。蛋白质抗原被降解为小片段，经测 序后确定抗体结合的位点。 要确定某一抗原的全部表位需要大量的时间。 现已可以通过诱变、蛋白质合成或蛋白竞争结合方法鉴定其 表位。此外，表位序列测定的应用对抗体结合表位的分析具 有显著的优越性。
应用肽合成技术合成连续的重叠的5～7肽，将这些合成的肽 与相应的抗体反应，分析检测结果，以确定阳性反应片段。 这一技术要求有明确的抗原的一级结构，并且检测结果为抗 原线性表位。 该法应用广泛，已研究抗原表位的蛋白有HIVgp41、寄生虫 蛋白、烟草花叶病毒(TMV)、Fy6蛋白、鸭肝炎B病毒(DHBV) 等。
2. 合成肽库方法
研究方法
肽库是大量某一长度(如六肽)的短肽的集合，它包括了该长度 的短肽的各种可能序列或其中的绝大部分。


2.1 有机合成法
有机合成法就是直接利用固相肽合成技术，合成含有各种可能序列的短 肽。通过这种合成可以保证各种序列的多肽等机率出现，每个载体上只 含有一种序列的短肽。
优点是构建方法简单，迅速。缺点是不能扩增，筛选比较麻烦，需进行 荧光标记或ELISA，在显微镜下操作工作量比较大。 在研究构象性表位时的minotopes方法即采用类似的方法，通常从二肽 开始合成并逐渐增加肽链长度及置换氨基酸种类，直至达到与抗体的最 大结合为止。
Nozaki-Tanford scale，Eisenberg scale，Kyte-Doolittle scale，HPLC scale，Hopp-Woods scale Hopp-Woods 方案认为：蛋白质抗原的氨基酸残基可分为疏 水性和亲水性两类。在机体内，疏水性残基一般埋在蛋白内 部，而亲水性残基位于表面，因此蛋白的亲水部位与蛋白抗 原表位有密切的联系。 Hopp-Woods方案是以残基由有机相环境转移到水相环境的 自由能为依据计算各个氨基酸的亲水性。现已明确，亲水性 部位与抗原表位并无很好的一致性，即高亲水性部位不一定 是表位，表位也不一定是亲水性部位。


水解后采用各种分离方法如SDS-PAGE、凝胶过滤、离子交换将水解片 段分开，然后用Western blot，ELISA等各种检测手段来检测。结果可通 过理论肽段分子量的推断或相应的氨基酸序列分析来判断。
利用该法分析抗原表位的有肌醇激酶、肌细胞增强蛋白、乙酰胆碱酯酶、 玻璃体结合蛋白、磷脂酶基质蛋白等。