血小板功能的检测及其应用-陈文明

用于监测药物抵抗的有光学法血小板聚集试验、 VerifyNow P2Y12 试验、Thrombelastograph Platelet Mapping system、Impact cone and plate（let） analyzer、PFA-100、FCM 分 析血小板活化标志物（P选择素）和血管扩张刺激磷蛋白 （VASP）磷酸化水平等。 ADP 诱导的光学法血小板聚集试 验虽可预测药物治疗的 不良反应， 但不适于临床大量样本 监测
• 聚集后的血小板发生变形、活化，分泌或释放一系列活 性物质，从多个环节上促进止血及血液凝固
止血过程
血管损伤
胶原暴露
血管收缩
血小板 粘附 聚集 释放
组织因子释放 凝血酶
血流减慢
血小板血栓
止血血栓
出血 血肿压迫血管
止血
纤溶酶
血管再通
凝血酶 血小板
PGG2/H2 TXA2
血管损伤 胶原暴露 血小板粘附 血小板初发聚集
分析前因素
• 检测部位 肘部屈侧下方， 3～4cm处，避开血管、伤口、 水肿、溃疡和疤痕组织
分析中和分析后因素
• 出血器的长轴与上肢平行，用血压计维持检测上臂血压在 40mmHg(儿童20mmHg)，每30秒用无菌滤纸擦拭伤口吸 入 流出的血液，直至出血停止
• 受某些药物（如阿司匹林、氯吡格雷等）的影响 • TBT敏感性、特异性均较差，更缺乏质量控制，不能作为
注意事项
• BPC采血静脉；若穿刺不顺利，则换部位采血
• EDTA钾盐抗凝，玻璃试管应该硅化或采用塑料试管；若 BPC明显减低，应该查看直方图 、外周血推片复核
• 若有证据显示待检患者血液中血小板计数因EDTA钾盐导 致假性减少，可以使用手指末梢血液显微镜下人工计数 血小板
• 检测前肉眼观察试管中有无细小 凝块，若存在应重新 抽血检测
血小板聚集时所产生的游离前列环素（PGI2）、血栓 素A2（TXA2） 很不稳定， 故现以测定其稳定的代谢产物 8-ISOPGF2a和11-DH-TXB2来判断PGI2和TXA2的水平， 两者血浆浓度不受操作或体外血小板活化的影响，故稳定、 敏感且特异，是反映体内血小板活化程度的可靠标志物。
床旁检测
• 使用含CTAD(柠檬酸、茶碱、腺苷和双嘧达莫)的塑料管 或真空采血管。避免血小板的活化
• 标本应该储存于18°C～24°C，禁止存放于冰箱中 • 检测前需要检查试管中有无小凝块。采血量9～12ml
分析中因素
• 每次检测中，应该保证测试条件一致，以免结果出现波动。 不同种类和不同浓度 的诱导剂，对疾病的诊断有重要意 义，应该有选择地组合应用
2.流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测血小板膜表面糖蛋 白（GP）
• 利用荧光标记不同的抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体，通过 FCM检测血小板膜上各种GP的表达与否，以诊断血小板黏 附和聚集功能缺陷性疾病
• 如巨血小板综合征缺乏GPIb-Ⅴ-Ⅸ 的表达，血小板无力症 缺乏GPⅡa/Ⅲa 的表达
血小板功能的检测及其 在出血与血栓性疾病中的应用
陈文明 首都医科大学附属北京朝阳医院
2013/9/16
血栓与止血的影响因素
1 血管壁(blood vessel wall)完整性 2 血小板数量和质量(platelet function) 3 凝血因子(coagulation)的量与活性 4 抗凝(anticoagulant)与
• 检测的小试管应该在18°C～24°C保存。采血后标本静置 30分钟，可以使血小板恢复到原有的反应性
分析后因素
• 血小板聚集率的变化，受到很多因素的影响。分析结果 时需要注意患者的饮食因素如服用含抗血小板功能的食物、 服用抗血小板药物以及其他的病理和生理状态影响血小板 的功能等情况
• BPC的降低，也是影响PAgT的重要原因
分析前因素
• 使用硅化的柠檬酸三钠真空采血管，顺利抽取静脉血，轻 轻颠倒混均后立即送检
• 标本应注意保温 ，避免血小板冷激活 • 采血30分钟内检测
分析中和分析后因素
• 血小板离体后极易被激活。因此，加样、混匀动作要轻柔
• 质控 ①阴性对照：非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、 单克隆荧光抗体特异性和纯度，应与试验管 抗体相对应。 在多色分析时，同型对照应与其它抗体同时使用，以避免 补偿造成的误差； ②血小板体外活化试验：使用正常人活化标本作为阳 性质控，正常人未活化标本作为阴性质控；
4Fra Baidu bibliotek
2013/9/16
③血小板自身抗体检测：使用含有已知血小板抗体 的血清与待检血小板孵育，作为阳性质控；不含血小板抗 体的血清与待检血小板孵育，作为阴性质控
④血小板表面抗原缺失：如巨血小板综合征血小板 表面CD42a/CD42b缺失或异常，血小板无力症血小板表 面CD41/CD61缺失或异常，使用正常人标本做阴性对照， 抗体的同型对照做阳性对照。 阴性对照管所有抗体浓度 及类型应该与被检测管
③释放血小板第3因子(PF3)，直接参与凝血反应
④活化的血小板在前激肽释放酶及高分子量激肽原 存在的条件下，直接激活FⅫ及FⅪ，启动内源性凝 血途径。
血小板异常引起的出血
GPIb-IX VWF
GPIIb-IIIa
纤维蛋白原
血小板减少
血小板粘附异常 GPIb缺乏：巨大血小板病 VWF缺乏：血管性血友病
氯吡格雷抵抗的检测
氯吡格雷和阿司匹林联合应用抗血小板治疗 成为行介入治疗（PCI）的患者防止血栓生成的 “金标准” 。行PCI 的患者对氯吡格雷治疗反 应有较大变异且治疗无反应率为5%～44。国外 研究多以基线水平与用药后血小板聚集率 （PAgT ）（20 μmol/L ADP）≤10％视为存在 药物抵抗
分析前因素
----采血操作 采血过程是否顺利，反复静脉穿刺 可以导致血小板 活化 ，致使BPC假性减少
----抗凝剂选择 肝素抗凝血不能用于BPC；EDTA钾盐抗凝血标本， 在少数患者可引起血小板聚集，致血小板假性减少
----储存时间影响 BPC标本应保存于室温，低温可激活血小板，储 存时间过久可导致BPC偏低。因此，标本应置室温，2h内完成检测
高凝状态、术前出血风险和术后出血的评估指标
一期止血缺陷出血性疾病诊断试验
（1）血小板数和功能缺陷： 常用血小板膜糖蛋白抗体检测和血小板功能试
验等 （2）血管缺陷：
常用血管性血友病（von Willebrand disease， vWD）相关试验和凝血酶调节蛋白 （thrombomodulin,TM）测定等
血小板聚集异常 GPIIb-IIIa缺乏：血小板无力症 纤维蛋白原缺乏：血小板聚集障碍
BT和BPC用于一期止血缺陷出血病的筛查
一期止血缺陷的检测
筛查试验
1. 血小板计数（blood platelet count,，BPC） BPC是指计算单位容积血液中血小板的数量，
血液分析仪法、显微镜下人工计数法、流式细胞术（金标准）
ELISA和MAIPA对诊断ITP的比较
ELISA
MAIPA
PAIgG PAIgA PAIgM GPⅡb/Ⅲa GPⅠb
阳性率(%) 81
27
22
54
13
敏感性(%) 88
66
60
75
66
特异性(%) 50
75
76
83
94
诊断效率(%) 72
27
22
73
13
抗血小板药物疗效监测
8-异前列腺素F2a (8-ISO-PGF2a)和11-去氢血栓素B2(11-DH-TXB2)的免疫测定
符合以下2 项及以上 ①VerifyNow-阿司匹林评分≥550 ②5 mmo/L ADP 为诱导剂时PAgT≥70％ ③0.5 mg/mL 花生四烯酸为诱导剂时PAgT≥20％
以上试验可受具体操作影响，存在一定的人为误差，年 龄、性别、种族、饮食、精神状态和红细胞比容水平等也 会影响试验结果，例如血小板聚集试验中选择不同的诱导 剂，试验结果亦可不同。另外，尿11-DH-TXB2受阿司匹 林剂量以及肾脏和其他非血管源TXA2影响。阿司匹林抵 抗的诊断缺乏一致性，这是目前以上试验不能广泛用于临 床的主要原因
• 异常增高的红、白细胞碎片可干扰BPC准确性
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2. 出血时间测定（bleeding time,BT）
• BT是指皮肤毛细血管被刺破后，从自然出血到自然止血所 需的时间（min）
• 反映皮下毛细血管的结构、舒缩功能以及血小板数量、功 能等情况
• BT是一期止血的重要筛查试验，目前推荐用 模板 （template）刀片法（出血器测定法，TBT），有助于发 现血小板与血管壁功能缺陷导致的出血倾向
组织因子
外源凝血系统 XIIa XII
凝血酶
内源凝血系统
ADP 儿茶酚胺
5-HT
血小板释放
pF3 纤维蛋白原 纤维蛋白
血小板初发聚集（大量）
血小板栓子 其它血细胞
止血与血栓形成
血小板止血功能
血小板 活化 机制
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血小板在止血过程中作用
①形成血小板血栓，机械性修复受损血管
②通过花生四烯酸代谢形成血栓素A2(TXA2)等具 有强烈收缩血管、诱导血小板聚集的介质
3.血小板膜糖蛋白（GP）特异性自身抗体检 测
• 原发性免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia,ITP）自身抗体的检测有多种方法，单 克隆抗体俘获特异血小板抗原检测（monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigen， MAIPA）是国际推荐的方法，其敏感性和特异性均较好
TEG (Haemoscope Corporation)
在肝素化血液中加入巴曲酶（商品名为立止血）和 凝血因子育可形成初级血栓，再加入花生四稀酸和ADP， 血小板聚集所引起的血小板纤维蛋白凝块的最大弹力度 可被该系统测量，且测量结果与浊度计集合度测定相关 联。该试验较好地反映了血栓形成和血栓溶解的信息， 但其监测抗血小板药物治疗的作用有待进一步研究
阿司匹林抵抗的检测
用于检测阿司匹林抵抗的试验包括血小板功能 试验BT测定、光学血小板聚集试验
近年出现的血小板功能试验包括PFA-100、 FCM、尿11-DH-TXB2和8-ISO-PGF2a的测定、 全血FCM、Impact cone and plate(let) analyzer 等
阿司匹林抵抗诊断标准
Verify Now 试验可克服血小板聚集试验的缺陷，已广泛用 于氯吡格雷及其他P2Y12 拮抗剂的监测。血管扩张刺激磷蛋白 （VASP） 磷酸化水平与服用氯吡格雷患者的P2Y12 受体反应 性相关，VASP 磷酸化与P2Y12 抑制相关，而VASP 非磷酸化状 态与P2Y12 的活化状态相关，监测两者的比值可判断氯吡格雷 抵抗程度。PFA-100 不适于监测氯吡格雷，因为胶原和ADP均 可激活ADP 受体，从而克服药物阻断，使血小板活化。氯吡格 雷抵抗存在变异， 原因可能为各试验涉及的药物剂量不同或血 标本反应时间不充足
纤溶(fibrinolysis)活性 5 血流变学
血小板的止血功能
1. 血管受损----内皮下胶原纤维暴露---- vWF的桥梁作用---血小板糖蛋白I b(GP I b)作为受体(血小板黏附)
2. 胶原、凝血酶等作用下，血小板糖蛋白Ⅱb、Ⅲa(GPⅡb、 IIIa)形成复合物（GPIIb/IIIa)，血小板以其为受体----纤 维蛋白原互相连接而聚集
包括快速血小板功能分析法（VerifyNow）、 Plateletworks、Impact cone and plate （let） analyzer、血栓弹力图[Thrombelastograph （TEG） PlateletMapping system]和血小板检 测等[9。
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1.血小板聚集试验（platelet aggregation test, PAgT） PAgT是一种血小板功能检测试验，应选择不同
种类和不同浓度的诱导剂，有助于与血小板聚集功 能相关的一期止血缺陷性出血病的诊断
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分析前因素
• 除BPC需正常外， 若用光学法检测，需要患者空腹采血； 阻抗法检测则无此限制
• 流式细胞术检测BPC的敏感性和特异性均较佳，特别是 在BPC≤20×109/L的标本复检时有重要价值
分析中因素
• 首先需要 保证检测系统状况正常，仪器、试剂配套，室 内、室间质控合格。
分析后因素
• 使用三分群血液细胞分析仪时，应注意小红细胞 或大血 小板对BPC的影响，注意血小板直方图的变化
• 检测结果异常的标本可以制备血涂片染色镜检，观察血小 板数量（正常可见8～15个/油镜视野），无 大量的血小 板凝块或大型血小板等