反相高效液相色谱中缓冲体系的PH选择
影响测定反相高效液相色谱流动相pH值的因素
９６
Modem Scientific Instruments 2005 1
４ 小 结
要准确调节流动相 ｐ Ｈ 值必须注意以下几点： １） 不能忽略 ２．４．２ 步骤，要仔细测好溶液温度，将 温度电位器调节好。 ２ ）由于高效液相色谱对流动相溶液的要求很严， 要求每次在配制流动相时的用水都必须是当天新鲜制 备的双蒸水（水的质量是至关重要的，否则会给后面的 色谱分离带来干扰）。刚烧好的双蒸水水温较高，一般 会达到 ４５℃，如果未让它冷却到室温就调节流动相 ｐＨ 值，会造成流动相 ｐ Ｈ 值的较大偏离，从而导致整个 色谱分析实验的偏差甚至失败。因此，刚烧好的双蒸 水一定要冷却到室温后再进行 ｐ Ｈ 值的调节。 ３）复合电极经较长时间使用，如发现仪器反应迟钝， 测量数字长时间飘移，不能稳定测量，一般情况很可能是 电极老化， 须更换新电极。它的使用寿命一般为一年。
柱 温：３０℃； 检测器：二极管阵列检测器； 检测波长：２１４ｎｍ； 流动相：０．４ｍｏＬ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４ 溶液，Ｈ３ＰＯ４ 调 ｐＨ 值至 ２．４。 在上述色谱条件下九种有机酸得到有效分离（见图 ２）。 ２．４ 流动相 ｐＨ 值调节 １） 酸度计电极插拔去 Ｑ９ 短路插；接上复合电极， 用蒸馏水冲洗电极，然后浸入邻苯二甲酸氢钾缓冲溶 液（ＧＲ 邻苯二甲酸氢钾 ２．５５ 克，溶解于 ２５０ｍＬ 的重蒸 馏水中）。 ２） 将“斜率”电位器顺时针旋到底，“选择”开 关置“Ｔ ”，将“温度”电位器调到数显所显示的温度 值为实测的溶液温度值。 ３） 再将“选择”开关置“ｐＨ”档，调节“定位” 电位器，使数显所显示的 ｐ Ｈ 值为该温度下缓冲溶液 的标准值（见表 １），仪器标定结束，此时“定位”等 各个旋扭就都不能动了。
［２］ 于世林． 高效液相色谱方法及应用，北京：化学工业出版社，２０００．８５ ［３］ 赵景婵，郭治安，常建华等．有机酸类化合物的反相高效液相色谱法的分
反相超高效液相色谱法测定水质中的乙酸含量
反相超高效液相色谱法测定水质中的乙酸含量作者：谭松林来源：《绿色科技》2017年第20期摘要：研究了反相超高效液相色谱法测定水质中乙酸含量的色谱条件。
结果表明：在Waters T3（50 mm×3 mm×1.8 μm）色谱柱上，以NaH2PO4（20 mM/L，pH=2.6）/H3PO4缓冲液作为流动相，210 nm处紫外检测水质中的乙酸；其流动相流速为0.2 mL/min，柱温30 ℃，进样量1.0 μL。
该方法简便快捷，样品加标回收率为68.5%～72.1%。
关键词：乙酸；反相超高效液相；紫外检测中图分类号：X832文献标识码：A文章编号：16749944（2017）200040021引言水体中少量的乙酸不仅表现为酸性，而且使其化学需氧量增高，这对水系统的生态平衡和人的身体健康带来严重的危害，因此快速便捷的检测水质中的乙酸含量在环境监测中显得尤为重要。
目前对乙酸的分析方法主要要有滴定法、薄层层析法、分光光度法、荧光法、气相色谱法以及酶法等[1～4]。
而这些方法或需经预分离和衍生化等前处理，或精准度不高，而且操作繁琐。
笔者采用反相超高效液相色谱法，直接进样测定水质中的乙酸含量，具有操作简单快捷、准确度高的优点。
2实验部分2.1实验原理水样经0.22 μm的水相滤膜或针式水相滤头过滤后直接进样，采用反相超高效液相色谱进行检测，以保留时间定性，峰面积定量计算样品中乙酸的含量。
2.2样品的采集与保存水样采集于1000 mL棕色玻璃瓶中，1～5 ℃冷藏，尽快分析，分析前将样品自然升至室温。
采样瓶预先用洗涤剂洗一次，自来水洗三次，蒸馏水洗一次。
2.3仪器及试剂Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪；美国Millipore（simplicity 185）超纯水机；0.22 μm滤膜针式过滤器和0.22 μm水相滤膜；吉尔森移液枪（1000 μL、100 μL、10 μL）；868型酸度计。
反相液相色谱柱使用缓冲液需要注意哪些 液相色谱如何操作
反相液相色谱柱使用缓冲液需要注意哪些液相色谱如何操作反相液相色谱柱接受高纯和高机械强度的硅胶，接受先进的键合技术制备而成, 色谱柱表面键合率高，覆盖完全，对碱性和酸性化合物具有良好的峰形。
色谱柱柱容量高，反相液相色谱柱接受高纯和高机械强度的硅胶，接受先进的键合技术制备而成, 色谱柱表面键合率高，覆盖完全，对碱性和酸性化合物具有良好的峰形。
色谱柱柱容量高，寿命长，是一款具有较高性价比的色谱柱。
反相液相色谱柱在使用缓冲液的过程中还要注意以下几点：a、避开使用盐酸盐，盐酸盐对钢质有腐蚀作用；b、缓冲液可以要现配现用，往往缓冲液是良好的菌类培育液，隔天或放置长时间试验时会发生很多怪现象；c、使用缓冲液要适时把握pH范围，做到胸中有数；d、清洗液路和柱子时，有温控可加热到30摄氏度易于冲洗；e、长时间用缓冲溶液要注意察看接头处有无析出，若有白色盐类析出，定期用10%硝酸冲洗液路可以避开液路的堵塞；f、选择缓冲液要用牢靠的试剂，避开不纯的盐类造成不必要的麻烦；过渡流动相是指有机相和水相的构成与分析流动相相同，但是不含缓冲盐的溶液。
—专业分析仪器服务平台,试验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣扬媒体。
相关热词：等离子清洗机,反应釜,旋转蒸发仪,高精度温湿度计,露点仪,高效液相色谱仪价格,霉菌试验箱,跌落试验台,离子色谱仪价格,噪声计,高压灭菌器,集菌仪,接地电阻测试仪型号,柱温箱,旋涡混合仪,电热套,场强仪万能材料试验机价格,洗瓶机,匀浆机,耐候试验箱,熔融指数仪,透射电子显微镜。
高效液相色谱仪分析样品的种类繁多、物理形态广泛、构成及其浓度多而杂多变，对分析结果的干扰因素很多，为达到分析目的，样品要进行有效的制备。
高效液相色谱仪分高效液相色谱仪分析样品的种类繁多、物理形态广泛、构成及其浓度多而杂多变，对分析结果的干扰因素很多，为达到分析目的，样品要进行有效的制备。
高效液相色谱仪分析样品的制备包括预处理、提取、净化和浓缩等过程。
HPLC常规实验建议使用的缓冲盐体系
HPLC常规实验建议使用的缓冲盐体系高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于生物化学、药学、环境科学等领域。
在HPLC实验中，缓冲盐体系可以起到调节溶液pH值和维持离子强度稳定的作用，从而优化分离效果和保护色谱柱。
以下是一些常见的HPLC常规实验建议使用的缓冲盐体系。
1.磷酸盐缓冲体系：磷酸盐缓冲体系是HPLC实验中最常用的缓冲盐体系之一、磷酸盐缓冲体系可以提供广泛的pH范围（2-8之间），同时磷酸盐还具有对许多生物分子和有机分子的良好溶解性。
常见的磷酸盐缓冲液有二氢磷酸盐（pH2-3）、三氢磷酸盐（pH6-8）和磷酸盐缓冲液（pH2-8）。
磷酸盐缓冲体系在酸性和碱性条件下都能保持相对稳定的离子强度，使得色谱实验结果更加稳定可靠。
2.醋酸盐缓冲体系：醋酸盐缓冲体系主要由醋酸或乙酸和醋酸钠组成，可以在中性和酸性条件下提供稳定的pH值。
醋酸盐缓冲体系对酸敏感的样品非常适用，因为其pH范围（4-6之间）适合大多数生物分子的分析。
3.磺酸盐缓冲体系：磺酸盐缓冲体系主要由有机磺酸盐和无机磺酸盐混合而成。
磺酸盐缓冲液可以在酸性和碱性条件下提供稳定的pH值，适用于许多分析。
磺酸盐缓冲液在药物研究和分析中经常使用，特别是在分析天然产物和药物衍生物时。
4.磷酸氢盐/磷酸二氢盐混合缓冲体系：磷酸氢盐/磷酸二氢盐混合缓冲体系可以在酸性和中性条件下提供稳定的pH值。
该缓冲盐体系常用于酸敏感化合物的分离和分析，尤其在药学研究中广泛应用。
总之，选择适当的缓冲盐体系是HPLC实验成功的关键之一、在选择缓冲盐体系时，需要考虑样品的特性、分离条件和目标分析物的pH值范围。
此外，还应注意选择高纯度的缓冲盐、准备新鲜的缓冲液，以保证实验结果的准确性和重复性。
反相色谱法中缓冲盐的选择
反相色谱法中缓冲盐的选择-现代液相色谱技术导论读书笔记（二）反相色谱法在色谱中是最广泛的应用，分离中性样品和离子样品的首选。
中性样品：样品不带正电荷或者负电荷的分钟哦，通常是由于样品酸或碱被离子化的结果。
虽然一个中性分子意味着该样品没有酸性或碱性分子，然而实际情况并非如此。
依赖于流动相的pH，样品中酸或碱可能在很大程度上（比如90%以上）体现出中性的（非离子化）形式，在这种情况下，色谱图和非离子化的化合物非常类似。
离子化样品：酸、碱、酸碱混合物（含或不含中性化合物）。
色谱柱常使用C18或C8，流动相常使用水和有机相的混合溶液。
常用的有机溶剂为CAN（首选），甲醇，异丙醇，四氢呋喃等。
水相通常是缓冲盐。
（一）流动相pH的确定在RPC中，色谱柱是非极性的，流动相是极性的。
极性很强的分子和极性的流动相之间作用更强烈，在色谱柱行保留较弱，首先离开色谱柱。
同样的，极性较弱的分子与非极性的色谱柱左右，后离开色谱柱。
因此大小接近的类似分子在RPC的洗脱大致随着他们的极性减低而减慢。
RPC的保留很大程度上是溶质分子和流动相或者色谱柱相互作用的结果。
增加B%（有机相），会使流动相极性减小，增加溶质和溶剂的相互作用，溶质分子的保留都减少。
提高温度同样减少溶质的保留。
色谱柱疏水性增加同样会减少溶质分子的保留，如同一样品在氰基柱上比C18柱较快出峰（氰基柱的极性比c18强）。
较高的极性会缩短样品在RPC上的保留时间。
离子化会显著提高酸或碱的极性，从而导致该物质在RPC中的保留因子K下降。
非电性分子离子化分子酸：HA ⇄A-+ H+碱：B+H+ ⇄BH+疏水性亲水性当pH增加时，酸失去质子而离子化，使在RPC中保留降低，当pH降低时，碱获得质子而离子化，使在RPC中保留降低。
离子化的酸和碱俊宇他们的酸度系数Ka相关。
当pH等于pka时，分子和离子化各占50%。
下图表示pH影响RPC保留行为的例子。
碱性化合物pka=5，从上图可以看出，在Ⅰ和Ⅲ阶段（在pka±1.5之外），保留时间随着pH 变化不大，在Ⅱ阶段（pka±1），保留时间随着pH变化呈线性关系。
液相常见缓冲体系的选择
反相高效液相色谱缓冲体系PH的选定反相高效液相色谱缓冲体系PH的选定反相高效液相色谱中缓冲体系PH值的选择在反相高效液相色谱分析中，选择正确的缓冲液PH值，对可离解的化合物分析的重现性十分重要，不恰当的PH值可能导致不对称峰，宽峰，分裂峰或肩峰，而尖锐的，对称的峰是定量分析中获得低的检测限以，两次分析之间较低的相对标准偏差（RSD）和保留时间的高重现性的前提。
我们将讨论在使用缓冲液时如何选择缓冲液的PH值，以及如何选择正确的缓冲体系。
什么时候需要缓冲溶液？在反相液相色谱分析中，流动相的PH值一般在2.5－7之间，当被分析物在反相条件下可离解，或样品的PH值在2.5－7之外时，就需要缓冲液。
在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基和羧基，他们的Pka在1－11之间，选择正确的缓冲液PH值可保证可离解的官能团以一种形式存在，离子形式或中性化合物的形式。
如果样品的PH值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和从而减小其危害。
如何选择缓冲液PH值在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个PH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰，从HH公式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液PH值高于或低于Pka两个单位，化合物中99％以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。
让我们通过一个例子来看如何选择PH值例如苯甲酸图（一）图（一）显示的是它的离子形式和中性化合物的转变，苯甲酸的Pka等于4.2，理论上由HH公示得知，当溶液PH值等于2.2时，99％的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等于6.2时99%的苯甲酸以离子形式存在，所以当缓冲液PH值等于2.2时，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱，表1列出了一般缓冲液和他们的缓冲范围。
从表1知磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液能用于PH值等于2.2。
表1PhosphatePka12.11.1－3.1Pka27.26.2－8.2Pka312.311.3－13.3CitratePka13.12.1－4.1Pka24.73.7－5.7Pka35.44.4－6.4Formate3.82.8－4.8Acetate4.83.8－5.8Tris（hydroxymethyl）aminomethane8.37.3-9.3ammonia9.28.2-10.2borate9.28.2-10.2diethylamine10.59.5-11.5当化合物只有氨基时，缓冲体系的选择十分简单，大多数氨基化合物在PH值小于9时都被质子化，所以所有PH值在7或更低的溶液均适合应用，你也许会问水的PH值大约是7，为什么还用缓冲盐，因为缓冲盐有助于增加方法的可靠性，以及色谱峰的尖锐性，PH值的降低有助于氨基化合物保留的减弱，减小化合物与硅胶表面硅羟基的作用，而使峰更尖锐，从表1 可值，任何缓冲液均可应用于氨基化合物的分析，但我们认为PH值等于3的磷酸钾盐最适合用于氨基化合物的分析。
反相高效液相色谱法测定盐酸莫西沙星氯化钠注射液的含量
反相高效液相色谱法测定盐酸莫西沙星氯化钠注射液的含量黄玫
【期刊名称】《现代医药卫生》
【年(卷),期】2011(027)010
【摘要】目的:采用反相高效液相色谱法测定盐酸莫西沙星氯化钠注射液的含量.方法:色谱柱为DIKMA Inertsil Ph,4.6 mm～250 mm 5μm,流动相为磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾1.0 g、四丁基硫酸氢铵0.5 g和磷酸3.4 g,加水溶解并稀释至1000 mL)-甲醇=72:28;检测波长293nm;流速1.3mL/min;柱温45℃;进样量
10μL.结果:盐酸莫西沙星在82.12～110.35μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系,r=0.9992,日间、日内RSD均小于1.5%.结论:本方法准确可靠,可用于盐酸莫西沙星氯化钠注射液的质量控制.
【总页数】2页(P1481-1482)
【作者】黄玫
【作者单位】重庆市长寿区人民医院,重庆,401220
【正文语种】中文
【中图分类】R9
【相关文献】
1.HPLC法测定盐酸莫西沙星氯化钠注射液中r脱羧莫西沙星的含量 [J], 王鹏;于黎鑫;刘玉玉
2.HPLC法测定盐酸莫西沙星氯化钠注射液中N-甲基莫西沙星含量 [J], 郑家晴;于
黎鑫;王艳敏;郭丽娟
3.反相高效液相色谱法测定盐酸倍他司汀氯化钠注射液中主药含量 [J], 逯小萌
4.HPLC法测定盐酸莫西沙星氯化钠注射液中脱羧莫西沙星的含量 [J], 王鹏;于黎鑫;刘玉玉
5.反相高效液相色谱法测定硫酸西索米星氯化钠注射液的含量 [J], 侯玉荣;范青峰;史孙亮;袁耀佐;张玫
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
液相流动相缓冲盐选择
下面内容综合了Agilent和网上查到的一些资料：一般来说，反相HPLC的流动相包括有机相和水相，有机相常用的为色谱甲醇和乙腈，不太常用的还有四氢呋喃和异丙醇。
甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。
但是当样品峰形不好或者分离不好时，更换溶剂是一个很好的选择，因为不同的溶剂可提供不同的选择性。
在反相色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。
对于离子型化合物，典型样品的保留随pH改变而明显变化，因此控制pH对于保留和选择性的稳定非常重要，通常在pH2~4的条件下，保留时间对pH的微小改变稳定性最高，因此建议将这一pH范围作为大多数样品方法开发的起始pH，包括碱性化合物和一般的弱酸。
考虑到重现性，所用的pH应高于或低于待分析物pKa或pKb上下一个pH单位。
当待分析物pKa或pKb未知时，应测试一种以上流动相pH（如pH2.0和pH6.5缓冲盐溶液），可提供最好结果。
对流动相的优化主要体现在水相上。
流动相pH值对色谱分离的影响有多钟方式，根据待分析物的结构性质，pH可能影响选择性、峰形和保留。
如果是非极性较强或中性的化合物，pH对分离度和保留的影响一般不明显。
如果是可离子化的化合物，如酸或碱，保留因子和选择性随pH改变非常明显。
（1）酸性分析物，应选择低pH缓冲液流动相，以防止分析物离子化。
了解分析物的pKa，才能有效的选择流动相pH。
缓冲范围应在其缓冲液离子pK值±1 pH单位，使流动相的优化具有一定的灵活性。
例如，醋酸盐的pKa为4.8，缓冲范围为pH3.8~5.8。
反相高效液相色谱法同时测定维生素B6、烟酰胺和泛酸钙
and calcium pentot henate in some v itamin nutr iments. T he sample was extr acted ultraso nically w ith an ext ractant co nta ining pho sphate buffer solution ( pH 3. 0) and methanol fo r 5 min and then heat ed at 65- 70 e in a w ater bath for 10 min. T he ext ract obtained was used for the H PL C analysis. T he Inertsil pH- 3 Phenyl column was used as stat ionary phase, and a mix ed solution of 0. 05 mol # L - 1 K H2 PO 4 , methanol and acetonit rile mix ed in the ratio o f 90 t o 6 to 4 by vo lume, w as used as mobile phase. U V detection w as made at the wav elength of 210 nm. Linear ity of the st andard curves betw een the values o f peak area and concentr ation o f the 3 co mpo unds was checked by reg ression ana lysis, giving values of cor relat ion co eff icient s g reater than 0. 999 9. T est for r eco very w as made by standard addition met ho d w ith a substantial sample as the matr ix, the results o f reco very w ere fo und to be 97. 4% for v itamin B6, 100. 3% fo r calcium pento thenate and 102. 4% for nico tinamide.
反相高效液相色谱法测定九种有机酸
以采用反相高效液相色谱法测定九种有机酸为例，探讨了流动相pH 值对分析结果的影响。
实验结果表明pH=2.40 时，九种有机酸得到有效分离，且峰形理想，而不同pH 值对分析结果影响很大，不仅会大大改变各有机酸的保留值，甚至会导致无法将各有机酸分离。
本文分析了影响测定流动相p H 值的因素。
应用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析测定时，常常采用离子抑制法即向含水流动相中加入酸、碱或缓冲溶液等改性剂，以使流动相的p H 值控制一定数值，抑制溶质的离子化，减少谱带拖尾、改善峰形，以提高分离的选择性[1]。
例如在分析有机弱酸时，常向流动相中加入磷酸(或乙酸、三氯乙酸、1% 的甲酸、硫酸)，就可抑制溶质的离子化，获对称的色谱峰。
对于弱碱性样品，向流动相中加入1 % 的三乙胺，也可达到相同的效果[2~6]。
虽然RPC 方法建立时最好选用pH 微小改变不影响分离的流动相，但pH 值的较大变化往往会对分析结果产生很大影响，因此流动相pH 值的调节是分析过程中至关重要的一个环节，本文以反相高效液相色谱法测定九种有机酸为例考察了不同流动相p H 值对分析结果的影响，指出准确调节流动相p H 值的关键所在，有助于提高分析结果的准确性。
摘要以采用反相高效液相色谱法测定九种有机酸为例，探讨了流动相pH 值对分析结果的影响。
实验结果表明pH=2.40 时，九种有机酸得到有效分离，且峰形理想，而不同pH 值对分析结果影响很大，不仅会大大改变各有机酸的保留值，甚至会导致无法将各有机酸分离。
本文分析了影响测定流动相p H 值的因素。
应用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析测定时，常常采用离子抑制法即向含水流动相中加入酸、碱或缓冲溶液等改性剂，以使流动相的p H 值控制一定数值，抑制溶质的离子化，减少谱带拖尾、改善峰形，以提高分离的选择性[1]。
例如在分析有机弱酸时，常向流动相中加入磷酸(或乙酸、三氯乙酸、1% 的甲酸、硫酸)，就可抑制溶质的离子化，获对称的色谱峰。
高效液相色谱法培训考核试卷
1精密仪器组培训考核试题集部门：姓名：成绩：一、填空题（66分，每题6分）1、流动相的pH值应控制在之间，当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时，应选用；当色谱系统中需使用pH值小于2的流动相时，应选用。
2、剩余检品按月存放，暂存期至少为个月。
3、HPLC法中，除另有规定外，流速一般为。
4、对照品或标准品自冰箱中取出后，必须放置至，然后才可以在分之一天平上称量，新开启的在使用后，必须标注。
5、对照或标准溶液需要保存的，其有效性必须经，确定后方可使用。
6、在系统适用性试验中：分离度除另有规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度应；拖尾因子除另有规定外，应在之间。
7、对于要求梯度洗脱的样品，在样品分析前必须进行，以辨认杂质峰，如洗脱过程中基线漂移较大，亦可对色谱图进行处理。
8、配制好的流动相应通过um滤膜滤过，用前必须，否则容易在系统内，影响泵的工作、、检测器的灵敏度以及等。
对于规定pH值的流动相，应使用进行调节，除另有规定外，偏差一般不超过pH单位。
*9、当两份平行测试样品检验结果一份合格、另一份不合格时，不得将其，应视为。
两份平行测试样品检验结果相对偏差应。
10、在出现检验结果、检验结果时应启动OOS。
11、配制好的流动相应及时记录，记录应包括：、、、、等，配制好的流动相应储存于中，避免直射，有效期一般为。
*12、外标法求组分含量计算公式：。
*13、内标法求组分含量计算公式：。
14、相对偏差计算公式：。
*15、相对标准偏差计算公式：。
16、调整流动相组分比例时，以组分比例较低者（小于或等于50%）相对改变量不超过%且绝对改变量不超过%为限，如%相对改变的数值超过10%，则改变量以%为限。
2 17、一般情况下，对于反相色谱柱，如使用缓冲液或含盐溶液作为流动相，在试验结束后，应用%的甲醇/乙腈-水溶液冲洗，使色谱柱内的盐完全溶解洗脱出。
如色谱柱需长期保存，反相柱可以贮存于中，并将色谱柱两端，以免干燥，保存。
缓冲溶液的选择
在反相高效液相色谱分析中，选择正确的缓冲液PH值，对可离解的化合物分析的重现性十分必要，如果PH值不恰当可能导致不对称峰，宽峰，分裂峰，或肩峰，为能在定量分析中获得低的检测限，两次分析之间较低的相对标准偏差（R SD）和保留时间的重现性，尖锐的，对成的峰很必要，我们将讨论在使用缓冲液时如何选择缓冲液的PH值，以及如何选择正确的缓冲体系。
什么时候需要缓冲溶液？在反相色谱分析中，流动相的PH值一般在2.5－7之间，当分析物在反相条件下可离解，或样品的PH值在2.5－7之外时，就需要缓冲液，在反相条件下可离解的化合物一般有氨基和羧基，他们的Pka在1－11之间，选择正确的缓冲液PH 值可保证可离解的官能团处于一种形式，离子形式或中性化合物的形式，如果样品的PH值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和或减小其危害，如何选择缓冲液PH值在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个单位的值，有助于获得好的或尖的峰，从HH公式得知，溶液PH值高于或低于两个Pka两个单位，化合物99％以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰，让我们通过一个离子来看如何选择PH值例如苯甲酸图一显示的是他的离子形式和中性化合物的转变，苯甲酸的Pka等于4.2，理论上讲有HH公示得知，当PH值等于2.2时，99％的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等于6.2时99%的苯甲酸以离子形式存在，所以当缓冲液PH值等于2.2时，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱，表1列出了一般缓冲液和他们的缓冲范围。
从表以知磷酸和柠檬酸缓冲液能用于PH知等于2.2。
当化合物只有氨基时，缓冲体系的选择十分简单，大多数化合物在PH值小于9时都被质子化，所以所有PH值在7或更低时均适合应用，你也许会问水的PH 值大约是7，为什么还用缓冲盐，因为缓冲液有助于增加方法的可靠性，以及的尖锐性，PH值降低有助于氨基化合物保留时间减小，减小化合物与硅胶表面硅羟基的作用，而使峰更尖锐，从表1可值，任何缓冲液均可应用，但我们认为P H值等于3的磷酸钾盐最适合用于氨基化合物，在上面两个例子中PH＝3的磷酸钾盐都能获得良好的应用，在一般情况下，他是含羧基，氨基化合物分析中最好的缓冲液，并且我们认为在氨基分析中钾盐比钠盐更好。
如何选择液相色谱流动相PH和溶剂要求
如何选择液相色谱流动相PH和溶剂要求0000另外要注意以下3个方面:1.所选用流动相一定要能将峰检出--这个是基础条件，相信大家都知道。
2.流动相如为缓冲液，它的pH值应在它本身PKa的上下1个pH值内，如超出此范围，缓冲作用将大大减弱。
3.一般检测柱是C18，但使用C18柱时，流动相的pH值应在2~8之间，否则对柱子伤害较大。
根据以上要求，请选择适合自己实验的流动相。
c18反相柱对非极性的物质保留充分峰形对称，所以如果你的化合物是弱酸，记得好像流动相pHpKa-2时，弱酸就会基本以游离态存在，呈非极性，达很好保留出很好峰形!所以你的流动形相就的选择2~2.5当溶液PH值等于化合物的pKa时，化合物半解离。
在pKa±1.5的范围内，保留随PH值的变化而变化，超过此PH值范围，化合物完全解离或不解离，保留随PH值的变化很小。
了解化合物的pKa值，可在pKa±1.5的范围内调节流动相的PH值，以改变其保留，达到成分分离的目的。
或者，使流动相PH值超出这一范围，以保持保留的恒定，使建立的方法具有耐用性。
可参考《药物分析》化学工业出版社，盛龙生等P235~237谢谢楼上各位的热心解答，但你们讲的都不大一样，我该怎么确定呢?根据分析化学,当弱酸(弱碱)溶液中溶液中离子浓度是分子浓度的100倍时,可以认为是完全电离的,化合物完全以离子形式存在;当弱酸(弱碱)溶液中溶液中分子浓度是离子浓度的100倍时,可以认为是完全不电离的,化合物以分子形态存在.因此,为了防止HPLC中峰的拖尾,应当保证化合物全部以分子或离子形态存在,即溶液的pH值应与pKa有2个单位的差别(pH≥pKa±2).如果化合物的pKa是4.5,溶液的pH值至少应该是2.5或6.5.考虑到色谱柱的耐受性(pH=2~8;甚至是2.8~4.5)\保留时间\样品的复杂性要求,理论上你可以选择低pH值的流动相(pH2.5),也可以选择高pH值的流动相(pH6.5).至于最终选哪一个,做个对比就ok了.一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
高效液相色谱仪操作注意事项
高效液相色谱仪操作注意事项
流动相：
1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和有机系膜的使用范围，并进行超声除气处理。
2、水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质。
样品：
1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；
2、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；
泵：
1、泵在使用过程中不能把气泡泵进入仪器。
2、泵自清洗液体应该应经常更换（一般为一周）。
3、仪器在长期不使用时应把泵、流动相过滤器及管路保存在有机相溶剂条件下。
进样阀：
1、使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针针，洗针液一般选择与样品液一
致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；
2、手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的2倍以上；
色谱柱：
1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；
2、使用符合要求的流动相；
3、使用保护柱；
4、如所用流动相为含盐流动相，必须先用水与有机相相同比例流动相冲洗20分钟以上再换上含盐流动相反相色谱柱使用后，使用后，先用水与有机相相同比例的流动相冲洗，再用纯有机相冲洗。
5、色谱柱在不使用时，应用有机相冲洗，取下后紧密封闭两端保存；
6、不要高压冲洗柱子；
7、不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；
8、使用过程中注意轻拿轻放。
反相高效液相色谱法
反相高效液相色谱法
反相高效液相色谱法（RP-HPLC）是使用非极性固定相和极性流动相的一种液相色谱体系。
RP-HPLC是最主要的液相色谱分离模式，适用于几乎所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离。
其主要特点如下：
分离效果良好：反相液相色谱柱效高、分离能力强，能分离不同极性及强极性化合物，几乎适用于所有有机物的分离。
适用范围广：可广泛应用于生物大分子、蛋白质及酶的分离分析，并且受到越来越多的关注。
分析条件可优化：分离度与分辨率相对较好，通常是在还原水平上分析DAR（药物相关物质），即在非变性还原条件下打开链间二硫键，然后根据待测物质的极性大小进行分离，具有更好的分离度与分辨率。
此外，RP-HPLC在反相条件下使固定相与流动相之间的分配系数成为分离的关键参数。
组分在色谱柱上的保留程度，取决于它们在固定相和流动相之间的分配系数。
流动相为极性，固定相为非极性的液相色谱就是反相液相色谱。
液相流动相缓冲盐选择
下面内容综合了Agilent和网上查到的一些资料：一般来说，反相HPLC的流动相包括有机相和水相，有机相常用的为色谱甲醇和乙腈，不太常用的还有四氢呋喃和异丙醇。
甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。
但是当样品峰形不好或者分离不好时，更换溶剂是一个很好的选择，因为不同的溶剂可提供不同的选择性。
在反相色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。
对于离子型化合物，典型样品的保留随pH改变而明显变化，因此控制pH对于保留和选择性的稳定非常重要，通常在pH2~4的条件下，保留时间对pH的微小改变稳定性最高，因此建议将这一pH范围作为大多数样品方法开发的起始pH，包括碱性化合物和一般的弱酸。
考虑到重现性，所用的pH应高于或低于待分析物pKa或pKb上下一个pH单位。
当待分析物pKa或pKb未知时，应测试一种以上流动相pH（如pH2.0和pH6.5缓冲盐溶液），可提供最好结果。
对流动相的优化主要体现在水相上。
流动相pH值对色谱分离的影响有多钟方式，根据待分析物的结构性质，pH可能影响选择性、峰形和保留。
如果是非极性较强或中性的化合物，pH对分离度和保留的影响一般不明显。
如果是可离子化的化合物，如酸或碱，保留因子和选择性随pH改变非常明显。
（1）酸性分析物，应选择低pH缓冲液流动相，以防止分析物离子化。
了解分析物的pKa，才能有效的选择流动相pH。
缓冲范围应在其缓冲液离子pK值±1 pH单位，使流动相的优化具有一定的灵活性。
例如，醋酸盐的pKa为4.8，缓冲范围为pH3.8~5.8。
常见缓冲液配制方法
乙醇－醋酸铵缓冲液(pH3.7) 取5mol/L醋酸溶液15.0ml，加乙醇60ml和水20ml,用10mol/L 氢氧化铵溶液调节pH值至3.7，用水稀释至1000ml，即得。
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0) 取三羟甲基氨基甲烷12.14g,加水800ml,搅拌溶解，并稀释至1000ml,用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0,即得。
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.1) 取氯化钙0.294g,加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液40ml使溶解，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.1，加水稀释至100ml，即得。
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH9.0) 取三羟甲基氨基甲烷6.06g,加盐酸赖氨酸3.65g、氯化钠5.8g、乙二胺四醋酸二钠0.37g，再加水溶解使成1000ml，调节pH值至9.0，即得。
乌洛托品缓冲液取乌洛托品75g，加水溶解后，加浓氨溶液4.2ml，再用水稀释至250ml,即得。
巴比妥缓冲液(pH7.4)取巴比妥钠4.42g,加水使溶解并稀释至400ml，用2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.4，滤过，即得。
巴比妥缓冲液(pH8.6)取巴比妥5.52g与巴比妥钠30.9g,加水使溶解成2000ml，即得。
巴比妥－氯化钠缓冲液(pH7.8)取巴比妥钠5.05g,加氯化钠3.7g及水适量使溶解,另取明胶0.5g加水适量，加热溶解后并入上述溶液中。
然后用0.2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.8，再用水稀释至500ml，即得。
甲酸钠缓冲液(pH3.3) 取2mol/L甲酸溶液25ml，加酚酞指示液1滴，用2mol/L氢氧化钠溶液中和，再加入2mol/L甲酸溶液75ml,用水稀释至200ml,调节pH值至3.25～3.30,即得。
邻苯二甲酸盐缓冲液(pH5.6) 取邻苯二甲酸氢钾10g，加水900ml,搅拌使溶解，用氢氧化钠试液(必要时用稀盐酸)调节pH值至5.6,加水稀释至1000ml，混匀，即得。
有机酸类化合物的反相高效液相色谱法的分离条件研究
有机酸类化合物的反相高效液相色谱法的分离条件研究
有机酸类化合物的反相高效液相色谱法的分离条件包括以下几个方面：
1. 色谱柱选择：常用的反相色谱柱有C18、C8、C4等，选择
合适的色谱柱是保证分离效果的关键。
2. 流动相：流动相的组成对分离效果有很大影响。
一般情况下，酸性有机酸类化合物采用酸性流动相，有助于提高分离效果。
常用的流动相是乙腈/水或甲醇/水体系，可以根据具体样品的
性质进行优化。
3. pH值的调节：pH值的调节能够影响有机酸类化合物的溶解
性和离子化程度，进而影响分离效果。
调节pH值可以通过添
加酸或碱来实现。
4. 柱温：柱温的调节对于某些样品的分离效果有一定的影响，一般情况下，较高的柱温可以提高分离速度，但也可能降低分离效果，需要根据具体的样品来进行优化。
5. 流速：流速的选择也是影响分离效果的一个重要因素。
过高的流速可能导致分离不完全，而过低的流速则可能导致分离时间过长。
一般情况下，流速在1-2 mL/min之间较为合适，根
据具体的样品进行调节。
总之，有机酸类化合物的反相高效液相色谱法的分离条件需要
综合考虑柱选择、流动相组成、pH值的调节、柱温和流速等因素，并根据具体的样品进行优化。
高效液相流动相的选择
高效液相流动相的选择 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020高效液相色谱流动相选择流动相1.流动相的性质要求一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
流动相选择1：由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。
2：三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。
这是一个聪明而又省力的办法。
调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。
3：粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。
选择流动相时应考虑以下几个方面：①流动相应不改变填料的任何性质。
低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。
碱性流动相不能用于硅胶柱系统。
酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
②纯度。
色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
③必须与检测器匹配。
使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。
当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。
④粘度要低(应<2cp)。
高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。
最好选择沸点在100℃以下的流动相。
⑤对样品的溶解度要适宜。
如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。
⑥样品易于回收。
应选用挥发性溶剂。
流动相的pH值采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
反相高效液相色谱中缓冲体系的PH选择
在反相高效液相色谱分析中，选择正确的缓冲液PH值，对可离解的化合物分析的重现性十分重要，不恰当的PH值可能导致不对称峰，宽峰，分裂峰或肩峰，而尖锐的，对称的峰是定量分析中获得低的检测限以，两次分析之间较低的相对标准偏差（RSD）和保留时间的高重现性的前提。
我们将讨论在使用缓冲液时如何选择缓冲液的PH值，以及如何选择正确的缓冲体系。
什么时候需要缓冲溶液？
在反相液相色谱分析中，流动相的PH值一般在2.5－7之间，当被分析物在反相条件下可离解，或样品的PH值在2.5－7之外时，就需要缓冲液。
在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基和羧基，他们的Pka在1－11之间，选择正确的缓冲液PH值可保证可离解的官能团以一种形式存在，离子形式或中性化合物的形式。
如果样品的PH值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和从而减小其危害。
如何选择缓冲液PH值
在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个PH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰，从HH公式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液PH值高于或低于Pka两个单位，化合物中99％以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。
当化合物只有氨基时，缓冲体系的选择十分简单，大多数氨基化合物在PH值小于9时都被质子化，所以所有PH值在7或更低的溶液均适合应用，你也许会问水的PH值大约是7，为什么还用缓冲盐，因为缓冲盐有助于增加方法的可靠性，以及色谱峰的尖锐性，PH值的降低有助于氨基化合物保留的减弱，减小化合物与硅胶表面硅羟基的作用，而使峰更尖锐，从表1 可值，任何缓冲液均可应用于氨基化合物的分析，但我们认为PH值等于3的磷酸钾盐最适合用于氨基化合物的分析。
在上面两个例子中，PH＝3的磷酸钾盐都能获得良好的应用，在一般情况下，它是含羧基和氨基化合物分析中最好的缓冲液，并且我们认为在氨基化合物分析中钾盐比钠盐更好。
为离子对试剂选择缓冲液
为应用离子对试剂的方法选择缓冲液的过程是相似的，离子对试剂例如四丁基铵的盐，十四烷基磺酸钠等，在流动相中可与化合物中可离解的官能团配对，在缓冲液中以离子形式存在的化合物就需要应用离子对试剂。
应用缓冲液PH值来调节方法选择性
如前面提到的，氨基化合物的保留随PH的减小而降低，这个特性可以用来调节方法的选择性，如果两个化合物共流出，一个含有氨基，适当改变PH值就可以用来分离这一物质对。
由于可离解化合物的选择性依靠PH值，所以变化PH值也可以用来鉴别未知化合物的官能团，如果PH值变小，出峰便快，则化合物中可能存在氨基，当PH变大,化合物出峰很快，或流出在死时间处，化合物可能是一种羧酸，因为羧基离子化后流出大大快于比质子化的中性化合物。
总结
正确选择缓冲溶液在反相液相色谱方法中对于优化尖峰，捡出限，以及获得稳定的保留时间十分重要，如果你知道化合物官能团信息和化合物的Pka值这一过程将十分简单。