细胞培养实验室操作准则2014.10版

细胞培养实验室操作准则
任何首次准备开展细胞实验的人员必须首先认真阅读以下准则，然后在已经熟练掌握细胞培养操作技术人员的指导下开始进行细胞实验，并在以后的实验过
程中严格遵守各项准则。

一、细胞实验准备
1.进入细胞房前要换鞋，穿无菌服（干净实验工作服），戴手套，接触细胞前喷75%酒精消毒手套。

2.将所需实验用品：培养基（完全培养基、空白培养基）、胰酶（含ETTA）、枪头（1ml、200ul、10ul)、离心管，预先放置到超净工作台，打开紫外照射30min 后开始细胞实验。

3.观察细胞前，用75%酒精纱布擦拭显微镜镜头及台面，进行消毒后方可开始观察细胞。

4.观察细胞主要包括：细胞数量（汇合度）、形态、分布情况（是否均匀）、有无漂浮的死细胞和污染等，观察完及时放回培养箱。

（如图，汇合度约90%，分布均匀）
5.每次开始细胞实验前，需关闭紫外照射，打开超净台风机及灯。

用含75%酒精的纱布擦拭超净工作台。

超净台内物品放置情况：左侧（各式枪头，及可常温放置的试剂如PBS等），右侧（5ml枪头及镊子），废弃瓶位于右上角，尽可能远离操作区域，正前方为枪和酒精灯，培养基及胰酶放置左侧便于取用。

6.超净台在使用前后，都需用含75%酒精的纱布擦拭台面至纱布上看不到明显脏物为止，每天操作后废液缸需清洗用紫外照射，此外，从外面拿进超净台的东西都要喷75%酒精消毒。

7、每周四需更换培养箱中高压过的超纯水，每周五对超净台（包括风机）、细胞培养房卫生进行打扫，每月对培养箱进行消毒清洗，确保细胞不受污染。

8、检查培养箱的CO2含量是否正常，如出现异常及时联系细胞平台相关负责人。

9、5mL枪头清洗高压的流程:(1)用洗洁精将枪头超声一遍（2）更换干净的自来水超声清洗3遍（3）用超纯水超声清洗1遍（4）将枪头捞出后再用超纯水荡洗3遍（5）放入烘干箱烘干（6）装在铁盒中，注意枪头放置顺序一致，放入高压锅，选择橡胶类（7）高压后放入烘干箱烘干后方可拿入细胞房使用
1ml、200ul、10ul装入枪盒后放入高压锅高压烘干后方可拿入细胞房使用
二、细胞传代
1.细胞传代前要观察细胞，细胞汇合度达到80%-90%时可以进行传代。

图片
2.以25cm2培养瓶为例：打开培养瓶瓶盖，将盖子地面朝下放在超净台台面上，然后将培养瓶倾斜，用量程5ml的枪将旧培养基吸走，然后用量程1ml枪加1ml 空白培养基轻轻摇匀清洗，用5ml枪将清洗的培养基吸走。

注：75cm2加3ml空白培养基清洗
3.加入胰酶（含EDTA）500ul；然后轻轻摇晃培养瓶，注意让所有细胞都要接触到胰酶，放入37度培养箱消化。

注：75㎡大瓶加1500ul胰酶、6孔板加300ul 胰酶、12孔板加200ul胰酶
4.消化时间长短根据不同细胞有不同选择，镜下观察大部分细胞变圆，见大部分细胞脱落即可终止消化。

5.25cm2培养瓶加入2ml完全培养基终止消化。

注：75cm2培养瓶加5ml完全培养基终止消化、6孔板加1.5ml完全培养基终止消化、12孔板加1ml完全培养基终止消化。

6.用5ml枪头轻轻吹打细胞后，观察底部大部分细胞已脱落，然后倾斜培养瓶，将细胞混悬液转移到15ml离心管，800r/min条件下离心3min。

7.离心时，准备新的培养瓶，标记好细胞的名称、日期、代数。

8.离心结束后，弃上清液。

缓缓沿壁加入5ml新鲜的完全培养基，计数（方法参见后面）。

9.重悬细胞，用量程5ml枪，枪打到第一档，深入管底部，轻轻吸取离心管底部的整个沉淀的细胞团和培养基，然后沿管壁缓慢匀速打下，枪头随着液面的的上升而逐渐上提，这样可避免产生气泡。

按此方法反复几次，待细胞混匀后，吸取细胞混悬液，加入新培养瓶，按所需比例进行传代即可。

细胞传代的比例是根据所需细胞的数量以及时间来决定。

如需急用可用低的比例（1:2,1:3）传代，并每天换液，如时间充裕，不用时可适量加大传代比例（1:4,1:5），并3天换液，减少细胞的代数，暂时不用细胞只需留一小瓶培养即可。

10.进行十字型摇匀，有序放入培养箱中。

注意事项：
1、需要进行细胞实验前，合理扩大培养，尽量安排在同一代数情况下做实验。

2、在进行细胞实验时，不可同时处理两种及以上细胞，避免交叉污染。

三、细胞计数：（计数前操作与传代相同）
1、消化后的细胞充分混匀后，用10ul枪吸取l0ul细胞混悬液，再吸取10ul 台盼蓝，在1.5ml离心管中将两者混和均匀后，将20ul混合液注入计数板。

2、打开计数器，确认红色指示灯亮起，蓝色指示灯在第几格，一般为第一格，旋转选择正确区域。

3、打开计数软件“count star”,标明日期及细胞名称，选择比例1:1，细胞类型为，注意观察细胞分布，如果不均匀，应重新混匀后计数。

4、记录内容：细胞总数，死细胞数，细胞活力（一般活力在95%以上）及活细胞数。

（活细胞数用于计算接板所需的细胞量）
5、将计数板及时从count star取出，关闭软件，计数完成。

四、细胞接种：
1、细胞计数完后，正确计算所需的细胞量和培养基的量，取一洁净的皿，将细胞混悬液和完全培养基分别加入皿内。

2、混匀：先用5ml枪混匀，然后取排枪混匀后，先加一孔到96孔板中，去镜下观察分布是否均匀，如若不均匀需再次混匀，确保均匀后再加入。

避免产生气泡，如有少许气泡可用10ul枪头戳破。

每次吸取液体后需观察高度是否一致和准确。

3、对于接板的细胞，96孔板可先静置一会再放入培养箱，避免摇动，以免细胞
集中在中央。

例如：需接一块96孔板，细胞密度为0.5*105，细胞计数----活细胞数为5*105个/ml
需稀释的倍数为5*105除以0.5*105等于10倍，一块96孔板需要12ml，故需细胞悬液的体积为12ml除以稀释位数10等于1.2ml，其余的量用完全培养基补足。

注意事项：
无论是接种在6孔板、12孔板、24孔板和96孔，培养皿或者培养瓶中，都需要先加入一孔、一个培养皿或一个培养瓶在镜下观察细胞悬液分布是否均匀，若发现细胞有抱团、成束现象需重新混匀后方可接种。

附不同板底面积
五、细胞冻存：
1、订购新细胞之前需查阅相关的文献，选择合适的细胞，并仔细阅读说明书（培养的条件包括培养基等），准备好细胞培养所需的相关试剂及耗材。

1、买来后传一个25cm2小瓶，记为第一代---P0，若细胞状态不好可每天换液，长满后1:3传3个小瓶，记为第一代P1，然后根据细胞的生长速度长满后按1:6传6个大瓶，记为P2，保种5大瓶，另一大瓶可开始用于实验，以此类推，详细记录细胞的代数。

冻存时写上细胞名称、冻存日期及细胞的代数。

2、细胞消化离心后，去掉上清液，快速加入冻存液，充分混匀后装入冻存管。

3、一般一瓶75cm2的瓶子可冻存3-4小管，标号细胞名称，冻存日期和细胞代数，用封口膜封口，放入程序性降温盒置于-80℃冰箱过夜，第二天置于液氮中
保存。

4、放入液氮时，注意放入正确的位置，记录好冻存细胞的位置，顺序按时间先后排，时间前的放外面。

六、细胞复苏
1、复苏前准备：将所需物品放入超净台，打开紫外照射约半小时，75%酒精擦拭台面。

2、准备15ml离心管，加入5ml培养基。

3、提前打开37℃水浴锅预热，从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其全部融化，更换新手套。

4、用75%酒精喷洒冻存管后，擦拭台面，打开盖子，1ml枪头吸出细胞悬液，加到含培养基的离心管，充分混匀；
5、离心，800r，3min；
6、弃去上清液，重悬细胞，加入完全培养基到25cm2的小瓶子，在显微镜下观察细胞状态，然后放入37℃培养箱静置培养；
7、注意观察细胞状态，及时换液。

8、细胞复苏后，根据细胞的特性，按适当的比例传到75cm2的大瓶子，每天换液，长满后立即保种，并记录细胞的代数，细胞状态稳定后方可开始实验。

8、复苏后观察细胞如果发现一小瓶有很多细胞，立即传到大瓶子
七、细胞加药
1、细胞加药前需在镜下观察细胞形态和数量，根据具体实验对细胞覆盖率的要求不同。

一般药物作用24h是在细胞长到50%-60%时加药。

2、计算好所需配置的量，准备离心管，配药可采用两种方法：（1)配置最高浓度，再进行倍比稀释配成所需各浓度。

（2）分别配置所需的各种浓度。

配完药后注意要上下混匀！
3、加药时沿孔板壁加，避免产生气泡，加完后注意检查有无气泡，小气泡需用小枪头捅破，以免影响药物的均匀分布。

4、加药后，立即放入培养箱。

例如：1、一块96孔板加药，复方熊胆粉(FF)储存液浓度为500mg/ml（PBS配置），我们需要配置成0、1.25、2.5、5mg/ml的工作液各1ml，采用倍比稀释法，准备4个5ml的离心管，在0、1.25和2.5mg/ml的离心管中分别加入1mlDMEM完全培养基，然后将500mg/ml的工作液稀释成最高浓度5mg/ml，然后过滤，加入2ml到5mg/ml的离心管中。

八、细胞污染处理混匀后加1ml
0mg/ml 1.25mg/ml 2.5mg/ml 5mg/ml
混匀后加1ml
2ml(5mg/ml) 1mlDMEM 1mlDMEM
1mlDMEM
1.我们实验室一般较少细胞污染，细胞污染时多出现不明游动物体、底部有连片黄色斑点、出现絮状或毛线状的菌落等，常伴有明显不适气味。

2、一经发现细胞污染，立刻上报不得隐瞒。

马上将被污染细胞移出培养箱（不要开盖，防止细胞交叉污染），在细胞房外向瓶内注入新洁尔灭，盖紧瓶口，扔进医疗垃圾桶。

3、将培养箱中的细胞，逐一在镜下观察是否已交叉污染，如发现已交叉污染做污染细胞处理，排除隐患后，将正常细胞移到另一培养箱中。

4、关闭污染培养箱的电源开关，将隔板取出，用新洁尔灭(1:1000-1:2000)擦拭，确保每个角落都擦到，后进行紫外照射2小时。

箱内除用洁尔灭擦拭外，还需用75%酒精擦拭，确保每个角落都不能遗漏。

5、将水槽清洗干净后用75%酒精擦拭，用新高压的超纯水换掉原先的水。

6、细胞移回的一周内，要细心观察是否污染的现象再次出现，一般污染为偶然事件，如再次出现就不是培养箱的问题，而是培养箱外部的问题如培养基、操作、外部带环境等。

十、常用试剂的配制及保存
1、完全培养基的配置：空白培养基+1%双抗（Hyclone)+10%胎牛血清（目前使用的是Gibco灭菌过滤过的，配置时无需过滤）
例如：500ml的DMEM空白培养基+55mlFBS+5.5ml双抗
空白培养基：4℃保存。

双抗：-20℃保存，100ml/瓶，15ml离心管分装，用前解冻，避免反复冻融。

FBS：-20℃保存，500ml/瓶，50ml离心管分装，用前常温解冻，避免反复冻融。

胰酶（不含EDTA）：-20℃保存，500ml/瓶，50ml离心管分装，用前常温解冻，避免反复冻融。

冻存液
2、MTT的配置：250mgMTT粉末+50mlPBS配置成5mg/ml的储存
液，超声至完全溶解，分装100小管，每管500ul，
标记好浓度和日期，用锡箔纸包好后放在-20℃避光保存，用时根据所需的量取用，用后不再放回。