天然菌斑生物膜中细菌的空间分布

天然菌斑生物膜中细菌的空间分布

姬亚昆，凌均棨，张垲

中山大学口腔医学研究所，广州（510060）

E-mai:jiyakun203@

摘要：目的：研究天然菌斑生物膜初期形成中细菌（包括死菌和活菌）的空间分布。方法：通过釉质磨片从牙齿表面获得完整的1h、4h、8h、12h、24h天然菌斑生物膜标本，应用激光共聚焦扫描显微镜和死菌/活菌荧光染色技术相结合的方法，对各时段的天然菌斑生物膜中死菌/活菌进行原位、实时的动态观察。结果：天然菌斑生物膜形成初期，底层结构稀疏，主要由死菌组成，约占70%～80%；中间层细菌密集，主要由活菌组成，约占40%～70%，包括许多周围有活菌围绕的管道和空隙；顶层结构同底层，活菌较少，约占20%～40%。结论：天然菌斑生物膜死菌和活菌分布不均匀，顶层和底层主要由死菌组成，中间层主要由活菌组成；死菌是菌斑生物膜形成初期的组成部分之一；随时间延长，生物膜中的细菌排列逐渐密集，包括丰富的管道系统。

关键词：菌斑生物膜；死菌/活菌；激光共聚焦扫描显微镜

生物膜（Biofilm, BF）是由基质包裹的相互粘附或附着于与液体环境相接触的体表及界面的微生物群体[1]。牙菌斑是一种典型的细菌性生物膜，是人类口腔两大感染性疾病——龋病和牙周病的主要致病因素[2]。对这两种口腔常见病、多发病的预防主要在于控制牙菌斑，而了解天然菌斑生物膜的空间结构是控制菌斑的理论基础之一。研究发现，口腔中的死菌参与天然菌斑生物膜的初期形成，具有促进菌斑生物膜形成的作用[3]。本实验的目的是将激光共聚焦扫描显微镜和死菌/活菌荧光染色技术结合应用，对死菌/活菌在天然菌斑生物膜中的空间分布进行观察研究，以期为菌斑的有效控制提供理论基础和实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

死菌/活菌荧光染色剂：L-7012 LIVE/DEAD BacLight TM Bacterial Viability Kit（Molecular Probes, USA）

LSM 510型激光共聚焦扫描显微镜（Zeiss, Germany）

1.2 方法和步骤

1.2.1 釉质磨片的制备

收集拔除的成人正常第三恒磨牙。去除表面的菌斑，清洗干净。将其制备成（5×5×1.5mm）的釉质磨片，清洗。用600-、1000-、2000-碳化硅砂纸潮湿条件下抛光，超声清洗20min，风干。常规高温高压消毒[3,4]。

1.2.2 菌斑生物膜的形成及获得

将釉质磨片用光固化复合树脂粘结于志愿者的上颌第一恒磨牙颊面。共7名志愿者(均为青年，

口腔卫生状况良好)。进行正常的日常牙齿护理（仅限于漱口和刷牙），注意标本的保护。1h、4h、8h、12h、24h后用探针取下釉质磨片。将釉质磨片用指甲油粘结于载玻片上，置于消毒PBS中(避免样本干燥而使厚度减少)。立即运回实验室，进行死菌/活菌荧光染色。

广东省自然科学基金自由申请重点项目，广东省自然科学基金自由申请项目。

1.2.3 死菌/活菌荧光染色

（1）荧光染液的配制

荧光染色剂为L-7012 LIVE/DEAD BacLight TM Bacterial Viability Kit（Molecular Probes, USA），含有两种荧光染液SYTO-9和PI，其中SYTO9使活菌发出绿色荧光，PI使死菌发出红色荧光，从而可以在镜下区分活菌和死菌。荧光染液的配制按SYTO9︰PI︰蒸馏水=1.5ul︰1.5ul︰1ml比例将3种试剂加入同一离心管，振荡混匀备用。每一标本用染液200ul。以上操作均在避光条件下进行[5]。

（2）菌斑生物膜的荧光染色

将生长有菌斑生物膜的牙釉质片用1ml 消毒PBS液轻轻洗涤，以去除未粘附的细菌。取200ul上述荧光染液滴于釉质磨片表面的菌斑生物膜，室温下，黑暗孵育15min。黑暗环境下，用消毒PBS液轻轻洗涤生物膜标本，以去除表面附着物。风干[5]。

（3）封片

黑暗环境下，于生物膜上滴上1滴p-苯二胺抗淬灭剂（90%甘油，10%PBS，pH为8.5～9.0，其中p-苯二胺浓度为2-7mM/L），再滴1滴甘油/碳酸盐缓冲液封片剂(甘油与碳酸盐

∶，其中碳酸盐缓冲液浓度为0.5M/L，pH为9.0～9.5)。4℃避光存放或缓冲液体积比为11

立即镜检。

1.2.4 激光共聚焦扫描显微镜观察

将上述标本置激光共聚焦扫描显微镜下观察。其中死菌为红色，活菌为绿色。每个生物膜标本由内（生物膜和玻片相贴的一面）向外（生物膜游离的一面）逐层沿Z轴扫描。通过随机附带的专业软件处理，得到生物膜的断层扫描图像、三维重建图像以及生物膜的厚度。应用Image J图像分析软件分别计算死菌/活菌连续扫描图像最内一层、中间一层、最外一层红光和绿光的面积，分别代表生物膜内层、中间层、外层的情况，从而对死菌/活菌进行计数，计算活菌百分比，从而确定菌斑生物膜结构中死菌/活菌的空间分布情况。观察条件：氩激光（514/488nm），氦氖激光（543nm），物镜×20，目镜×10。

1.2.5 统计学分析

采用方差分析（ANOVA）方法进行检验，应用SPSS11.5软件进行统计学分析，α设在0.05。

2 结果

实验中观察到天然菌斑生物膜呈三维立体结构，形态多样。细菌之间可见许多管道和空隙，贯穿整个生物膜。天然菌斑生物膜形成初期，底层结构稀疏，主要由死菌组成，约占70%～80%；中间层细菌密集，主要由活菌组成，约占40%～70%；顶层结构同底层，活菌较少，约占20%～40%。统计分析显示，各时段菌斑生物膜内层、中间层、外层的活菌百分比均有差异（P＜0.05），中间层活菌百分比明显高于内层和外层，生物膜内层与外层活菌百分比除1h生物膜外，其它时间段均无差异（P＞0.05）（图1、2）。

图1 天然菌斑生物膜内层、中间层、外层平均活菌百分比

Fig1 The percentage of vital bacteria of native dental biofilms

图2 24h 天然菌斑生物膜死菌/活菌荧光染色激光共聚焦扫描显微镜观察图像（×200）

Fig2 Confocal laser scanning microscopic images: optical sections of 24h biofilm, live/dead bacterial

fluorescence staining （×200）

各时间段菌斑生物膜活菌百分比结果：在24h 内各时间段菌斑生物膜活菌百分比由内层往中间层逐渐增加，由中间层往外层又逐渐降低。菌斑生物膜的内层，也就是接近牙釉质表面的一层，从1h 到8h 活菌百分比逐渐升高，随着时间延长又有所降低，其中8h 时活菌百分比最高30.24%，而1h 活菌百分比最低8.96%。随着生物膜厚度的增加，其活菌百分比相应增高。中间层各时间段的活菌百分比处于43.39%～62.77%之间，其中24h 时活菌百分比最高62.77%，而1h 活菌百分比最低43.39%。菌斑生物膜的外层，也就是生物膜游离的一层，活菌百分比较中间层明显降低。菌斑生物膜从1h 到24h 活菌百分比处于17.86%～35.71%之间，其中24h 时活菌百分比最高35.71%，而4h 活菌百分比最低17.86%（表1）。