血清谷丙转氨酶活性的测定(改良赖氏法)

改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度( 改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低 浓度) 浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色 法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较 为一致，能较好反映酶的真实活性。 由于赖氏法设计的底物浓度, 由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度 只能达到最大速度的65%；显色剂2,4只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 新生成的丙酮酸和未用完的a 新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性 较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。
【实验原理】 实验原理】 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃ 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中 的丙氨酸与α 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加 生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加 成反应，生成丙酮酸-2,4成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中 生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围 内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。 内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。 据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过 标准曲线查出血清中ALT的活性。 标准曲线查出血清中ALT的活性。
二是比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 二是比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖 氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全 氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全 相同。不同之处在于作用时间：King法60min ，Mohun法和 Reiman法 相同。不同之处在于作用时间：King法 Mohun法和 Reiman法 30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是： 30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是： 每1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min，生成1μmol丙酮酸称为一个单 1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min，生成1μmol丙酮酸称为一个单 位。 Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作 用30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定 min，每生成2.5微克丙酮酸为1 义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1 义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单位 的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血 的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血 清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质 清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质 的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的 定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系： 1卡门氏单位=0.4821 IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。 卡门氏单位=0.4821 IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。
取干净试管12支，按下表所示标号，要求各S管和U 取干净试管12支，按下表所示标号，要求各S管和U管进行双管平行操 作。先做对照管和测定管，在30min保温期间再做空白管和标准管。 作。先做对照管和测定管，在30min保温期间再做空白管和标准管。
【实验结果】 实验结果】 1.赖氏法测定ALT的标准曲线(即计量反应曲线) 在 1.赖氏法测定ALT的标准曲线(即计量反应曲线) 坐标纸上以上表中An－ 0之值为纵坐标，相应的 坐标纸上以上表中An－A 0之值为纵坐标，相应的 酶活性的卡门氏单位为横坐标作图，即得赖氏法 测定ALT的标准曲线 测定ALT的标准曲线 2.标本中ALT活性结果 2.标本中ALT活性结果 ⑴查标准曲线 利用测定所得的吸光度结果(AU－ 利用测定所得的吸光度结果(AU－ AB)，便可从标准曲线上查得标本的ALT结果 AB)，便可从标准曲线上查得标本的ALT结果 ⑵计算 将实验测得的AU－AB 、AS 代入下面计 将实验测得的AU－ 算公式，即可算得标本中ALT活性 算公式，即可算得标本中ALT活性
尽管基质液中余下的a 尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝 醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm 醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm 的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用 标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光 度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他 比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续 监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规生化检验方法 监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规生化检验方法 学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理，全国肝炎 学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理，全国肝炎 协作会议也建议统一使用改良赖氏法。
【临床意义】 临床意义】 肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细 肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细 胞受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清 胞受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清 中ALT活性增高。测定ALT是检查肝功能的重要 ALT活性增高。测定ALT是检查肝功能的重要 指标之一。ALT显著增高见于各种急性肝炎及药 指标之一。ALT显著增高见于各种急性肝炎及药 物中毒性肝细胞坏死，中等程度增高见于肝癌、 肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高则见于 阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发 性肌炎亦可引起转氨酶活性升高。 思考题】 【思考题】 1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？ 1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？ 2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要 2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要 避免溶血？
【方法评价 】 ALT活性测定主要有两类。一是卡门氏（Karman） ALT活性测定主要有两类。一是卡门氏（Karman） 分光光度法，测定的是酶促反应速率。其原理如 下： 由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此 由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此 ALT的活性可通过NADH的减少量，亦即通过 ALT的活性可通过NADH的减少量，亦即通过 340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一 340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一 方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测 酶ALT的底物外，还需要加入指示酶LDH及其辅 ALT的底物外，还需要加入指示酶LDH及其辅 酶NADH，又需用紫外分光光度计，因此不易为 NADH，又需用紫外分光光度计，因此不易为 一般临床化验室推广。
血清谷— 血清谷—丙转氨酶活性的 测定（改良赖氏法）
Hale Waihona Puke 【目的要求】 目的要求】 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作 方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。