B细胞非霍奇金淋巴瘤患者IgH基因重排检测分析及意义_吴书一

B细胞非霍奇金淋巴瘤患者IgH基因重排检测分析及意义
吴书一1，秦亚溱2，刘文刚1，熊灵军3，刘艳荣2
1．郑州市第三人民医院干细胞与器官移植实验室，郑州450000；
2．北京大学人民医院血液病研究所，北京100044；3．郑州大学第二附属医院
摘要：目的探讨外周血和骨髓免疫球蛋白重链（Immunoglobulin heavy chain，IgH）基因重排检测方法及其在监测B细胞非霍奇金淋巴瘤（B－NHL）患者微小残留病（Minimal residual disease，MRD）中的临床意义。

方法应用PCR－SSP方法对B－NHL患者进行IgH基因重排检测，回顾性分析39例B－NHL患者IgH基因重排动态检测结果来了解其与临床MRD的关系。

结果39例B－NHL初诊未经治疗患者IgH基因重排检测34例阳性，阳性率87.1%（34/39）。

34例初诊阳性患者，治疗后19例达到临床完全缓解的患者中16例IgH基因重排转阴，3例持续阳性；15例临床部分缓解者，IgH基因重排持续阳性。

分析发现13例患者骨髓和外周血标本IgH基因重排均呈阳性。

结论IgH基因重排检测可以作为B－NHL的辅助诊断及其微小残留病的监测。

关键词：免疫球蛋白重链；基因重排；B细胞非霍奇金淋巴瘤
中图分类号：R733.1文献标识码：A文章编号：1672-3422（2011）03-0072-03
Clinical significance of immunoglobulin heavy chain
gene rearrangement in patients with B－Cell
non－Hodgkin’s lymphoma
WU Shu－yi，QIN Ya－zhen，LIU Wen－gang，XIONG Ling－jun，LIU Yan－rong
Laboratory of Stem Cell and Organ Transplantation，Zhengzhou
the Third People’s Hospital，Zhengzhou450000，China
ABSTRACT Objective To explore the methods of detection and clinical significance of immuno-globulin heavy chain gene rearrangement in patient with B－cell non－Hodgkin’s lymphoma（B－NHL）．Methods Detect IgH gene rearrangements of39B－cell non－Hodgkin’s lymphoma cases u-sing polymerase chain reaction/sequence－specific primers and monitoring of these gene rearrange-ments．Results Totally39cases of B－NHL without the treatment of newly diagnosed patients with IgH gene rearrangements detected34cases of positive，positive rate of87.1%（34/39）．34cases of newly diagnosed patients with positive，after treatment19patients achieve complete clinical remission，16cases in which negative，3cases of continuous positive．15cases were partial remission，IgH gene rearrangement continued positive．Conclusions IgH gene rearrangement can be detected as a B－NHL diagnosis and monitoring of minimal residual disease．
KEY WORDS Immunoglobulin heavy chain（IgH）；Gene rearrangement；B－cell non－Hodgkin’s lymphoma（B－NHL）
淋巴瘤是一种原发于淋巴结及其他淋巴组织的恶性肿瘤，其细胞的恶性克隆表现为多种基因异常，克隆性免疫球蛋白重链（Immunoglobulin heavy chain，IgH）基因重排被认为是B淋巴细胞克隆性增生的特异性标记之一，可作为B细胞非霍奇金淋巴瘤（B－NHL）的临床诊断和监测微小残留病（Minimal residual disease，MRD）的标志分子［1］。

本文应用PCR－SSP方法对B－NHL患者进行IgH基因重排检测，回顾性分析2006年3月至2010年6月39例B－NHL患者IgH基因重排动态检测结果来了解其与临床诊断及MRD检测中的临床意义。

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·医药论坛杂志2011年2月第32卷第3期
1材料与方法
1．1研究对象39例B－NHL患者源于2006年3月至2010年6月北京大学人民医院血液病研究所及郑州市第三人民医院，经病理学和免疫组织化学确诊，病例资料完整的患者，其中男24例，女15例，年龄14 70岁。

健康体检者为阴性对照，男、女各5例，年龄20 41岁。

分别取外周血或骨髓5ml，以EDTA－K2抗凝。

以B－NHL细胞系Raji细胞或已知具有IgH基因重排的DNA作为阳性对照。

1．2方法
1．2．1外周血或骨髓DNA提取EDTA－K2抗凝的外周血或骨髓5ml，用生理盐水倍比稀释，轻轻加至Ficoll淋巴细胞分离液上，2000rpm离心20min，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗2遍，转移至1.5ml离心管，加入500μl DNA zol（Invitrogen 公司）反复吹吸5分钟，加入500μl冷无水乙醇，颠倒数次，留取DNA絮状沉淀，加入80%乙醇洗涤1次，留取DNA，待晾干后加入适量去离子水，调整DNA浓度，保证A260/A280比值在1.6 2.0之间。

－20ħ冰箱保存备用。

1．2．2PCR引物设计与合成PCR引物设计参考文献［2］，由上海博亚生物技术有限公司合成，引物序列如下：FR3A：5－ACA CGG CCG TGT ATT ACT GT－3’，VLJH：5’－GTG ACC AGG GTA CCT TGG CCC CAG－3’。

1．2．3PCR扩增及产物检测25μl扩增反应体系包括10mmol/L TrisHCl（PH9.0），50mmol/L KCl，3.0mmol/L MgCl
2
，四种dNTP各400μmol/L，两条引物各200pmol/L，5%去离子甲酰胺，Tag酶0.6U，DNA0.5μg。

扩增反应条件：95ħ预变性5min；95ħ变性40秒，55ħ退火40秒，72ħ延伸60秒，共30循环；72ħ延伸7min，降温至4ħ。

取10μl PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染法显色，观察判断结果。

其扩增产物片段长度80 120bp。

1．3统计学处理应用SPSS11.0软件进行统计学处理。

2结果
Raji细胞系DNA及已知IgH基因重排阳性DNA经PCR扩增、银染显色后在80 120bp间呈现一条明亮的电泳条带，10例健康人无此条带。

39例经病理学和免疫组织化学确诊且未经治疗的B－NHL患者IgH基因重排检测34例阳性，阳性率87.1%（34/39）。

34例初诊阳性患者，治疗后19例达到临床完全缓解的患者中16例IgH基因重排转阴，3例持续阳性；15例临床部分缓解者，IgH基因重排持续阳性。

13例患者骨髓标本IgH 基因重排阳性，其同时进行的外周血标本IgH基因重排也呈阳性。

3讨论
恶性淋巴瘤分为霍奇金淋巴瘤（HL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）。

在我国NHL发病率在恶性淋巴瘤中占绝对优势（95%），其中又以B－NHL占绝对多数，其余为T细胞淋巴瘤和不能分型者［3］。

2001年WHO淋巴瘤新分类提出了以病理组织学为基础，结合免疫组化、基因分析的诊断方案，体现了基因检测对淋巴细胞恶性病变诊断的重要性。

B淋巴细胞IgH基因结构由可变区（Variable，V）、多变区（Diversity，D）、链接区（Joining，J）和恒定区（Constant，C）组成，这些区域上染色体分布呈不连续状态，片断之间可有长度不等的插入序列将其分开，当淋巴细胞发育到一定阶段，在重组酶的作用下重新排列组合，形成有功能性基因的特殊重排物，即基因重排［4］。

正常人每个淋巴细胞的重排基因都是独有的，因此B淋巴细胞的IgH基因重排形成了上千万种B淋巴细胞的IgH 基因重排的多克隆，PCR扩增产物片段长度可略有不同，聚丙烯酰胺凝胶电泳后常呈弥漫带而看不到单克隆重排带。

B－NHL患者，体内某种基因重排的B细胞癌变后失去机体的正常调控，无限制的分裂增殖，克隆性增生，导致其独有的基因重排形式占有一定优势，其PCR扩增产物电泳后出现一条明显条带。

因此，IgH基因重排带的单克隆检测对B－NHL辅助诊断及治疗后监测MRD的克隆性变化具有重要意义［2，5］。

本组回顾性分析，39例B－NHL初诊未经治疗患者，外周血或骨髓DNA检测发现IgH单克隆性基因重排带34例，阳性率87.1%（34/39），与Krose等［6］报道的B细胞淋巴瘤IgH基因重排阳性率77%，以及国内冯琦等［7］报道的阳性率83.3%相近；对照组10例健康人均未检测到IgH 单克隆性基因重排带，全部阴性；Raji细胞系DNA 及已知IgH基因重排阳性DNA均检测到IgH单克隆性基因重排带。

提示IgH单克隆性基因重排带阳性与B－NHL有良好的相关性，对B－NHL的
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辅助诊断具有重要价值。

随着先进生物治疗技术的开展和高效化疗药物的应用，许多B－NHL患者经过治疗大部分患者都可达到完全缓解或部分缓解，但其体内仍可能有不同程度的肿瘤细胞残留，是疾病复发的重要因素。

对于这些残存的极少量的肿瘤细胞，单靠常规的形态学或影像学很难证实。

多数学者研究认为，骨髓或外周血的IgH基因重排检测可从分子水平上来判断B－NHL的缓解程度，更有助于MRD的检测和提示临床预后［1］。

本组回顾性分析表明，34例B－NHL初诊时IgH基因重排阳性患者，经过4 6周期的化疗后19例达到临床完全缓解，15例临床部分缓解。

19例临床完全缓解者复查IgH基因重排，16例转阴，3例持续阳性，提示虽然达到临床完全缓解标准，但从分子水平上仍有3例未达到缓解，存在MRD，有复发倾向，应巩固治疗，定期监测IgH基因重排，及早预防复发。

本组分析显示临床完全缓解且复查IgH基因重排转阴者，提示已达到分子水平的完全缓解，患者预后良好。

15例临床部分缓解者，IgH基因重排均持续阳性，定期检测更有助于对诊疗效果做出判断，必要时调整化疗方案。

本组分析发现13例B－NHL患者骨髓标本IgH基因重排阳性，其同时进行的外周血标本IgH 基因重排也呈阳性。

国内应韶旭等［8］报告，骨髓单克隆IgH基因重排阳性率比外周血略高，但差异无显著统计学意义。

骨髓和外周血标本IgH基因重排检测结果一致，而外周血取材方便、痛苦少，患者易于接受，因此更易于临床推广。

总之，本组分析认为，外周血或骨髓IgH基因重排检测，可早期发现恶性增殖的B细胞克隆，对B－NHL明确诊断，早期、正确的临床治疗具有重要价值，同时作为临床缓解后MRD重要监测指标，对提示预后及疾病复发更具有指导性意义。

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2010-11-27收稿
（接71页）及时治疗、及时报告，以保证公众的用药安全。

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2010-11-21收稿
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