酵母双杂交
酵母双杂交
知识创造未来
酵母双杂交
酵母双杂交是一种实验技术，用于研究酵母菌的互作关系和蛋白质相互作用。
该技术基于酵母菌的能力，通过融合两个不同的酵母菌菌株，实现蛋白质的相互作用检测。
酵母双杂交的原理是利用一对可活化转录因子的融合蛋白，一个与实验蛋白A结合，另一个与实验蛋白B结合。
当A和B结合时，转录因子活化，启动报告基因的表达。
这种实验设置允许检测蛋白质A和B之间的相互作用。
通过酵母双杂交实验，可以筛查大量的蛋白质相互作用，从而揭示酵母菌细胞中复杂的信号传导网络。
这种技术被广泛应用于研究酵母菌的生物学过程、蛋白质功能以及疾病机制等方面。
它为揭示蛋白质相互作用网络提供了一种系统的方法。
1。
膜系统酵母双杂交原理
膜系统酵母双杂交原理酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。
大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。
双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。
细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。
80 年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的（modula r），即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA 结合结构域（DNA binding domain，简称为DB）和转录激活结构域（activation domain ，简称为AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。
单独的DB 虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。
而不同转录激活因子的DB 和AD 形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。
如酵母细胞的Gal4 蛋白的DB 与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42 融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4 结合位点并激活转录。
Fields 等人的工作标志双杂交系统的正式建立。
他们以与调控SUC2 基因有关的两个蛋白质Snf1 和Snf2 为模型，将前者与Gal4 的DB 结构域融合，另外一个与Gal4 的AD 结构域的酸性区域融合。
由DB 和AD 形成的融合蛋白现在一般分别称之为“ 诱饵” （bait）和“ 猎物” 或靶蛋白（prey or target protein）。
如果在Snf1 和Snf2 之间存在相互作用，那么分别位于这两个融合蛋白上的DB 和AD 就能重新形成有活性的转录激活因子，从而激活相应基因的转录与表达。
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术是一种常用的遗传交互技术，用于检测蛋白质之间的相互作用关系。
其原理基于两个主要组成部分：DNA 结合域和活化域。
在酵母双杂交系统中，常用的DNA结合域是DNA结合蛋白Gal4，它可以结合在特定的DNA序列上，形成Gal4-DNA复合物。
同时，活化域是Gal4的活化域，它具有激活靶基因表达的能力。
当两个蛋白质相互作用时，可以通过特定的实验设计，将待测蛋白质A与Gal4的DNA结合域、待测蛋白质B与Gal4的活化域结合，从而在酵母细胞中形成Gal4-DNA-A-B的复合物。
这个复合物可以激活靶基因的表达，从而使被激活的基因产生可观察的表型改变（比如生长能力、荧光等），表明蛋白质A 和B之间存在相互作用。
另外，在酵母双杂交系统中引入了质粒的概念，可以通过构建不同的融合质粒来进一步验证蛋白质相互作用的强弱以及特异性。
例如，可以构建融合质粒A-DNA结合域-AD活化域和融合质粒B-DNA结合域-BD活化域，并通过检测酵母细胞的表型改变来判断蛋白质A和B之间的相互作用。
总体来说，酵母双杂交技术基于蛋白质与蛋白质之间的相互作用，通过构建特定的融合质粒和酵母细胞表型改变的观察，来验证蛋白质之间的相互作用关系。
这项技术在生命科学研究中广泛应用，有助于揭示蛋白质网络的复杂关系和功能。
《酵母双杂交系统》课件
01
明确研究目标，确定需要验证的蛋白间相互作用或筛选与特定
蛋白相互作用的候选蛋白。
挑选合适的酵母菌株
02
根据研究目的选择适合的酵母菌株，如用于筛选候选蛋白的酵
母菌株或用于验证已知相互作用蛋白的酵母菌株。
构建诱饵和猎物蛋白的表达载体
03
将目的蛋白分别克隆到酵母表达载体上，构建诱饵和猎物蛋白
的表达载体。
应用领域
蛋白质互作网络研究
利用酵母双杂交系统可以大规模地筛选蛋白质之间的 相互作用，构建蛋白质互作网络。
疾病机制研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，有助于深入了解 疾病的发生和发展机制。
药物靶点发现
发现新的药物靶点，为药物研发提供新的思路和方向 。
02
酵母双杂交系统的实验流程
准备阶段
确定研究目的
基因表达调控研究
研究转录因子与DNA的结合
利用酵母双杂交系统可以筛选与特定DNA序列结合的转录因子，进而研究其在基因表达调控中的作用 。
发现新的转录因子
通过与已知转录因子的相互作用筛选，可以发现新的转录因子，进一步揭示基因表达调控的机制。
药物发现与设计
寻找药物靶点
利用酵母双杂交系统可以筛选与药物作用靶点相互作用的蛋白质，为药物发现提供潜在 的靶点。
对生命科学领域的影响与贡献
促进基础研究
酵母双杂交系统作为一种强大的研究工具，有助于深入揭示生命 过程的奥秘，推动生命科学领域的基础研究。
疾病机制与治疗研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，为疾病机制的解析和药物研发 提供有力支持。
生物技术产业
酵母双杂交系统的应用有助于推动生物技术产业的发展，如新药发 现、生物制品开发等。
酵母双杂交实验报告
酵母双杂交实验报告一、实验目的酵母双杂交技术是一种用于研究蛋白质之间相互作用的分子生物学方法。
本次实验的目的是通过构建酵母双杂交载体，转化酵母细胞，筛选出与目标蛋白相互作用的蛋白质，从而深入了解蛋白质在细胞内的功能和调控机制。
二、实验原理酵母双杂交系统基于真核转录调控因子的结构和功能特点。
转录调控因子通常由两个结构域组成：DNA 结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。
这两个结构域单独存在时不能激活转录，但当它们在空间上足够靠近时，则能够协同作用，激活报告基因的表达。
在酵母双杂交系统中，将编码目标蛋白（“诱饵”蛋白）的基因与BD 构建融合表达载体，将待检测的蛋白（“猎物”蛋白）的基因与 AD 构建融合表达载体。
如果“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白相互作用，那么 BD 和 AD 就能够在空间上靠近，从而激活报告基因的表达。
通过检测报告基因的表达情况，就可以判断“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白是否存在相互作用。
三、实验材料与试剂1、菌株与载体酵母菌株：AH109载体：pGBKT7（含 BD 序列）、pGADT7（含 AD 序列）2、工具酶与试剂盒限制性内切酶：EcoRI、BamHI 等T4 DNA 连接酶质粒提取试剂盒PCR 试剂盒3、培养基YPD 培养基SD 缺失培养基（Leu、Trp、His、Ade 等）4、试剂氨苄青霉素卡那霉素XαGal3-AT（3-氨基-1,2,4-三唑）5、实验仪器恒温培养箱离心机PCR 仪电泳仪凝胶成像系统四、实验步骤1、目的基因的扩增通过 PCR 技术从 cDNA 文库或基因组 DNA 中扩增出目标蛋白和待检测蛋白的编码基因。
设计合适的引物，在引物的 5'端引入限制性内切酶的酶切位点。
2、载体的构建分别用限制性内切酶对目的基因和载体进行双酶切，然后通过 T4 DNA 连接酶将目的基因连接到载体上。
将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，筛选出阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定和测序验证。
酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术原理
酵母双杂交技术是一种DNA定向克隆的分子生物学技术，又称为抗性转移技术。
它利用细胞壁抗生素的抗性性质作为分子生物学过程的引物，分子生物学的原理是利用噬菌体感染酵母的策略，将目标DNA 片段转移到仅有两种抗性的酵母菌中去。
具体的操作步骤如下：首先制备携带乙醇容抗体型剂量胞壁抗生素的噬菌体，再将酵母菌与这些抗生素装载的噬菌体混合放置，此时目标DNA会受到噬菌体的选择性感染，而不会感染来源酵母菌，进而将目标DNA进行吸收，最后再使酵母双向繁殖，最终形成携带抗性基因的酵母菌。
酵母双杂交系统步骤
酵母双杂交系统的步骤酵母双杂交法的原理：典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域和转录激活结构域。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
酵母双杂交法的步骤：1. 阳性克隆的筛选2. 用质粒自然分选法筛除只含有AD-文库杂合子的克隆3. 酵母杂合试验确定真阳性克隆4. 阳性克隆的进一步筛选和确证5. 对双杂交系统阳性结果的进一步研究6. 阳性克隆的筛选7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆8. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆9. 阳性克隆的进一步筛选和确证扩展资料：酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
主要是由于：1、采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。
2、信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。
3、杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。
4、通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。
同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中，有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用。
针对实际工作中的这种需要，Vidal等人发展了所谓的逆双杂交系统（reverse two-hybrid system）。
这项技术的关键是报道基因URA3的引入。
URA3基因在这里起到了反选择的作用，它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。
酵母双杂交系统的原理
酵母双杂交系统的原理嘿，你有没有想过，在细胞这个小小的世界里，就像一个神秘的微观宇宙一样，科学家们是怎么去探索那些蛋白质之间的相互作用呢？今天呀，我就来给你讲讲这个超级有趣的酵母双杂交系统的原理。
我先给你讲个小例子，你可以把细胞里的蛋白质想象成一群小工匠，它们在细胞这个大工地上各自有着不同的工作，而且有些小工匠之间还得合作才能完成一些大工程呢。
酵母双杂交系统就像是一个特别的侦探工具，用来找出哪些小工匠（蛋白质）是彼此合作的。
那这个系统到底是怎么做到的呢？这就得从酵母这种小生物说起啦。
酵母啊，它是一种很神奇的微生物，科学家们对它可算是相当了解了。
在酵母双杂交系统里，我们要用到酵母细胞里的一些特殊机制。
酵母细胞里有一些基因的表达是受到严格控制的。
比如说，有一些基因就像是一把锁，只有用特定的钥匙才能打开，然后这个基因才能开始工作（表达）。
这里的钥匙就是一种叫转录激活因子的东西。
转录激活因子就像是一个小队长，它有两个重要的部分，一个是DNA结合域（BD），这部分就像是小队长的手，能紧紧抓住特定的DNA序列；另一个是转录激活域（AD），这个部分就像是小队长的嘴巴，能喊来其他小伙伴（各种转录相关的蛋白），一起让基因开始工作。
那怎么利用这个来检测蛋白质之间的相互作用呢？科学家们可聪明啦。
他们把一种想要研究的蛋白质（我们就叫它蛋白A吧）和DNA结合域（BD）连接在一起，就像是给蛋白A穿上了一件有特殊功能的衣服，这件衣服的特殊功能就是能让它抓住特定的DNA。
然后呢，把另一种蛋白质（蛋白B）和转录激活域（AD）连接在一起。
现在，假如蛋白A和蛋白B在细胞里是相互作用的好朋友，那会发生什么呢？哈哈，这就像是两个小伙伴本来就约好了要一起玩一个超级有趣的游戏。
当蛋白A和蛋白B相互作用的时候，就相当于这两个小伙伴紧紧抱在了一起。
这时候啊，那个穿着BD衣服的蛋白A和穿着AD衣服的蛋白B因为抱在一起，就组成了一个完整的像小队长一样的转录激活因子啦。
酵母双杂交自激活
蛋白质相互作用在细胞生物学和疾病中的作用。
此外，酵母双杂交系统还可以用于筛选新的药物靶点或鉴定新
03
的治疗策略。
酵母双杂交系统的优缺点
优点
酵母双杂交系统具有高灵敏度和特异性，能够检测到低亲和力的相互作用。此外 ，它还具有高通量和高可重复性的特点，可以同时检测多个蛋白质之间的相互作 用。
缺点
然而，酵母双杂交系统也存在一些局限性。例如，它可能受到酵母细胞内其他因 素的影响，导致假阳性结果。此外，由于酵母细胞与人类细胞存在差异，因此某 些在酵母细胞中检测到的相互作用可能无法在人类细胞中重现。
蛋白质的相互作用可以通过多种方式进 在酵母双杂交实验中，了解蛋白质之间 行，例如通过蛋白质的直接接触或通过 的相互作用有助于预测自激活的可能性， 与它们相关的其他分子之间的相互作用。 并采取措施避免或减少这种现象的发生。
基因表达水平的影响
基因表达水平对酵母双杂交自激活也有重要影响。当一个基因的表达水平过高时， 它可能会产生过多的蛋白质，导致自激活。
2
该系统基于两种基本的酵母转录因子，即GAL4 和STE12，它们可以分别与DNA结合并激活转录。
3
当一个转录因子与另一个转录因子结合时，它们 可以形成一个杂合二聚体，从而激活转录。
酵母双杂交系统的应用
01
酵母双杂交系统被广泛应用于研究蛋白质之间的相互作用，特 别是在信号转导和转录调控领域。
02
它可以帮助科学家确定蛋白质相互作用的结构基础，以及研究
酵母双杂交自激活
目录
• 酵母双杂交系统简介 • 酵母双杂交自激活的发现与确认 • 酵母双杂交自激活的影响因素
目录
• 酵母双杂交自激活的调控策略 • 酵母双杂交自激活的实际应用 • 未来展望与研究方向
酵母双杂交 原理
酵母双杂交原理酵母双杂交（Y2H）是一种广泛应用于分子生物学领域的实验技术。
它基于酵母细胞内所含的转录因子结合区域分开的与激活区域结合的能力的原理而发展出来。
当把转录因子分成两个区域，一个称为DBD（DNA binding domain），另一个称为AD（activation domain），并使它们相互独立地与相应的配体结合时，它们就可以进行有效的转录激活。
通常来说，DBD和AD都不具有激活作用，但它们可以相互结合并发挥起激活作用。
因此，当DBD与某一DNA序列结合时，如果另一配体结合于AD，则该复合体就可以被转录激活。
基于这个原理，Y2H技术使用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为实验系统进行实验。
它使用了两个重要的质粒：一个称为“鱼钩”质粒（bait plasmid），它含有DBD和一个感兴趣的基因的DNA序列；另一个称为“猎物”质粒（prey plasmid），它含有AD和另一感兴趣的基因的DNA序列。
这两个质粒分别要被转化到两个不同的酿酒酵母分别作为它们的基因组。
当两个酵母的基因组都被转化后，它们被分别引入到含有选择性培养基的平板中去。
在这些平板上，只有那些同时表达了成功酯化的双杂交融合DBD和AD的细胞才能成长起来。
因此，这个实验系统几乎可以保证筛选到高亲合力的蛋白质因子。
值得注意的是，由于酿酒酵母是真核生物，与含有DBD和AD的两个质粒的匹配也是在真核生物级别上完成的，而不是简单的受体和配体之间的作用。
因此，这种技术可以很好地模拟在真核生物细胞内发生的相互作用。
Y2H技术不仅可以用于蛋白质因子的筛选，也可以用于检测DNA的相互作用。
例如，在要求蛋白质－DNA相互作用的特定细胞系上建立的实验系统中，可以使用这种技术来筛选那些与基因诱导子结合的转录因子。
因此，该技术可用于分析人类疾病中蛋白质相互作用的发生机制。
总的来说，酵母双杂交技术是一种强大而有效的分子生物学工具，可以用于研究蛋白质之间的相互作用以及转录机制。
酵母双杂交操作方法
酵母双杂交操作方法
酵母双杂交操作方法是一种将两个不同酵母菌株中的DNA融合在一起的技术。
以下是一般的酵母双杂交操作步骤：
1.构建表达载体：选用一类可以在两个酵母中进行表达的载体，如pGBT9和pGAD424。
2.设计探针：根据需要的目标蛋白选择相应的基因片段，构建带有核酸探针的质粒。
3.将两个不同酵母菌株分别转化：将上述载体和质粒分别转化到两个不同的酵母菌株中。
4.筛选正反应：将转化后的酵母菌株分别孵育在不同的选择培养基上，筛选出能够正反应的菌株。
5.验证结果：通过多种验证手段来确信寡配体与配体之间是否存在相互作用。
通过上述步骤，可以确定合适的酵母二杂交系统，并用于功能蛋白与蛋白相互作用的验证研究。
酵母双杂交 原理
酵母双杂交原理
酵母双杂交原理是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用和信号转导通路。
该技术利用酵母细胞中的两个互补的基因片段，将它们分别与两个感兴趣的蛋白质的编码基因融合，形成一个融合蛋白。
当这两个融合蛋白在酵母细胞中相互作用时，就会激活一个报告基因，从而实现对蛋白质相互作用的检测。
酵母双杂交技术的基本原理是利用酵母细胞中的两个互补的基因片段，将它们分别与两个感兴趣的蛋白质的编码基因融合，形成一个融合蛋白。
其中一个融合蛋白包含了DNA结合域，另一个融合蛋白包含了激活域。
当这两个融合蛋白在酵母细胞中相互作用时，就会激活一个报告基因，从而实现对蛋白质相互作用的检测。
酵母双杂交技术的优点是可以在活细胞中直接检测蛋白质相互作用，而不需要纯化蛋白质。
此外，该技术可以用于高通量筛选，可以同时检测多个蛋白质相互作用，从而加快了研究进程。
酵母双杂交技术的应用非常广泛，可以用于研究蛋白质相互作用、信号转导通路、基因调控等方面。
例如，利用酵母双杂交技术可以筛选出与某个蛋白质相互作用的蛋白质，从而揭示其功能和调控机制。
此外，该技术还可以用于筛选药物靶点，从而为药物研发提供新的思路和方法。
酵母双杂交技术是一种重要的分子生物学技术，可以用于研究蛋白
质相互作用和信号转导通路等方面。
该技术具有高通量、高灵敏度、高特异性等优点，是现代生命科学研究中不可或缺的工具之一。
酵母双杂交的原理和操作过程
酵母双杂交的原理和操作过程嘿，朋友们！今天咱来唠唠酵母双杂交这个神奇的玩意儿。
你说这酵母双杂交啊，就像是一场奇妙的分子之舞。
咱先来说说原理。
想象一下，酵母细胞就像是一个大舞台，而两种蛋白质呢，就像是两位舞者。
其中一个叫“诱饵”蛋白，另一个叫“猎物”蛋白。
如果这两位舞者能在这个舞台上牵手成功，也就是相互作用，那就会引发一系列的反应，就像舞台上绽放出绚丽的烟花一样，我们就能知道它们之间有故事啦！这是不是很有意思？接下来讲讲操作过程，那可是相当细致的活儿呢。
首先得准备好我们的酵母细胞，这就好比给舞者搭建好舞台。
然后呢，把带有“诱饵”蛋白的基因和一些报告基因导入到酵母细胞中，这就像是给舞台布置好了灯光和音乐。
接着，再把可能含有“猎物”蛋白的样本也加进去。
这时候啊，就等着看它们会不会在这个舞台上相遇并共舞啦！如果真的有相互作用，报告基因就会被激活，给我们发出信号。
在这个过程中，可不能马虎哟！每一步都得小心翼翼，就像呵护珍贵的宝贝一样。
比如说，基因的导入要准确无误，不然可就看不到精彩的“舞蹈表演”啦。
而且还要注意各种条件的控制，温度啦、湿度啦，都得恰到好处，不然这场分子之舞可就跳不起来咯！你想想看，通过这样一个看似简单却又充满奥秘的实验，我们就能揭开蛋白质之间那些神秘的关系。
这就好比我们在黑暗中找到了一盏明灯，照亮了我们对生命奥秘的探索之路。
做酵母双杂交实验就像是在解谜，每一个步骤都是解开谜题的关键。
当我们最终看到结果，知道了那些蛋白质之间的故事，那种成就感，哎呀，真的是没法形容！就好像我们破解了一个超级大秘密一样。
所以啊，朋友们，不要小看了酵母双杂交这个小小的实验，它里面蕴含着大大的智慧和乐趣。
让我们一起在这个奇妙的分子世界里尽情探索吧，说不定还能发现更多让人惊叹的秘密呢！这难道不让人兴奋吗？反正我是觉得超有意思的啦！。
酵母双杂交步骤
酵母双杂交步骤酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用和信号转导通路。
下面将介绍酵母双杂交的步骤。
第一步：构建酵母双杂交载体酵母双杂交载体是用于表达融合蛋白的质粒。
一般来说，酵母双杂交载体包括两个部分：DNA结合域（DBD）和激活域（AD）。
DBD 和AD分别与目标蛋白的DNA结合域和激活域融合，从而形成融合蛋白。
常用的酵母双杂交载体有pGBKT7和pGADT7。
第二步：构建酵母双杂交菌株酵母双杂交菌株是用于表达融合蛋白的酵母菌株。
一般来说，酵母双杂交菌株包括两个部分：DBD和AD。
DBD和AD分别与目标蛋白的DNA结合域和激活域融合，从而形成融合蛋白。
常用的酵母双杂交菌株有AH109和Y187。
第三步：酵母双杂交筛选酵母双杂交筛选是用于筛选蛋白相互作用的方法。
一般来说，酵母双杂交筛选包括两个步骤：初筛和确认。
初筛是通过生长选择培养基（SD/-Leu/-Trp）筛选出具有融合蛋白的酵母菌株。
确认是通过生长选择培养基（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）筛选出具有蛋白相互作用的酵母菌株。
第四步：酵母双杂交验证酵母双杂交验证是用于验证蛋白相互作用的方法。
一般来说，酵母双杂交验证包括两个步骤：β-galactosidase检测和Western blot检测。
β-galactosidase检测是通过检测酵母菌株中β-galactosidase的活性来验证蛋白相互作用。
Western blot检测是通过检测融合蛋白的表达来验证蛋白相互作用。
酵母双杂交是一种重要的分子生物学技术，可以用于研究蛋白质相互作用和信号转导通路。
通过构建酵母双杂交载体和酵母双杂交菌株，进行酵母双杂交筛选和酵母双杂交验证，可以得到蛋白相互作用的信息。
酵母双杂交技术的原理及应用
酵母双杂交技术的原理及应用酵母双杂交技术，听上去挺高级的名词对吧？别慌，其实它跟我们日常生活中的“拼爹”有点类似，不过它是在生物学里面玩的花样。
想象一下，你有两个朋友，想知道他们俩会不会成为超级好基友，那你可以用这个技术来一探究竟。
我们得有两种酵母，就像是两个潜在的基友候选人。
然后，我们给它们点刺激，让它们有机会结识、互动。
这个“刺激”就是让它们的基因混合在一起，看看能不能擦出什么火花。
这种技术背后的原理挺复杂，但想象成两个人打牌，要看看谁的牌更配对，就差不多了。
酵母也是，我们看它们的基因配对，看看哪些特征能够“一拍即合”。
而这个技术的应用可不少，不仅仅是让酵母们交朋友，还能帮助科学家们研究基因、了解生物的运作规律。
有了它，科学家们能够更准确地探索基因是如何影响生物性状的，就像解开谜题一样。
想象一下，如果你是一位厨师，你可能想知道为什么有些酵母可以让面包发得特别好吃，而有些却不行。
用这个技术，科学家们可以找出关键的基因，然后想办法让所有的面包都发得又快又好，那不就是个厨艺大咖吗？不过，别小看了这些酵母们，它们可是科学研究中的一把好手。
有了它们，科学家们能够在实验室里模拟各种情况，看看不同的基因组合会带来什么变化。
这就好像是一场“基因大混搭”，只不过最后得到的是科学数据，而不是时髦的搭配。
说到这些，我想起了一句俗语：“物以类聚，人以群分”。
这个技术就像是在研究生物界的“朋友圈”，看看谁跟谁更亲密、更默契。
也像是在研究生物界的“CP”配对，想知道哪些基因组合才是最佳拍档。
这个技术也有它的局限性。
酵母们虽然看起来基因搭配很好，但实际上在生活中却不一定能搭伙儿。
这就像是有些人看起来合得来，但真正相处起来可能却“水火不容”。
酵母双杂交技术不仅仅是一种实验方法，它还是科学探索的一把利器。
通过它，科学家们可以深入探索生物世界的奥秘，了解基因如何影响生物的种种特性。
就像探险一样，每次实验都是一次挖掘未知的冒险，不知道会有什么惊喜等着我们。
请详述酵母双杂交的基本原理和具体操作步骤。
请详述酵母双杂交的基本原理和具体操作步骤。
酵母双杂交是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质相互作用和基因功能。
酵母双杂交的基本原理是利用酵母细胞中的转录激活因子来检测两个蛋白质相互作用。
该技术基于转录激活因子在酵母细胞中诱导报告基因表达的原理。
核心思想是将需要检测
相互作用的两个蛋白质分别与两个互补的转录激活因子结合，从而使这两个转录激活因子
相互结合并激活报告基因的表达。
具体操作步骤如下：
1. 构建酵母双杂交载体：
- 选择一个载体，将一种转录激活因子的DNA序列插入该载体中的启动子和报告基因
之间，构建转录激活因子的融合蛋白。
- 在另一个载体上将另一种转录激活因子的DNA序列插入该载体中的启动子和报告基
因之间。
2. 转化酵母细胞：
- 将上述构建好的双杂交载体分别转化进酵母细胞中。
这一步骤常用的方法有直接转化、化学转化或电击转化。
- 在转化后，将酵母细胞培养至适当的条件，以使其能够自我复制并表达融合蛋白。
3. 鉴定蛋白相互作用：
- 将转化后得到的酵母细胞分别进行孵育和培养。
- 如果两个融合蛋白能够相互结合，其结合后的转录激活因子能激活报告基因的表达，则酵母细胞会在选择性培养基上生长，形成菌落。
- 将生成的菌落进行筛选和鉴定，确定其是否存在转录激活作用。
常用的方法有β-
半乳糖苷酶报告基因检测、荧光素酶报告基因检测等。
通过上述酵母双杂交的基本原理和具体操作步骤，可以很方便地研究蛋白质相互作用
和基因功能。
酵母双杂交原理
酵母双杂交原理酵母双杂交原理（Yeasttwo-hybridsystem）是由Levinthal和Briggs于1993年提出，用于发掘蛋白质们之间的相互作用的一种方法。
它运用一种特殊的载体来拆分蛋白质，再将其放入酵母菌中，使得蛋白质能够彼此结合成复合物。
事实上，酵母双杂交原理可以揭示特定蛋白质之间的非结构化但重要的功能关系，它是生物学研究工作中非常有用的工具。
酵母双杂交原理的主要原理酵母双杂交原理的主要原理是将两个蛋白质分别放入一个载体中，然后将该载体放入到酵母菌中进行杂交。
其中，一个蛋白质被称为“bait”，另外一个被称为“prey”。
接着，这些杂交菌就会分泌两个蛋白质，这就产生了蛋白质结合的可能性。
如果两个蛋白质能够结合在一起，就可以通过一定的实验手段来证明它们之间有相互作用。
酵母双杂交原理的研究和应用自酵母双杂交原理被提出以来，它已经被广泛应用于生物学研究中，包括蛋白质结构功能的发现，以及调控细胞过程的研究。
例如，可以使用酵母双杂交技术来研究两个蛋白质之间的相互作用，以确定其中一个蛋白质是如何影响另一个蛋白质的表达和活性的，以及揭示蛋白质在细胞中所扮演的角色。
除此之外，酵母双杂交原理也用于药物开发中，如通过这种方法可以确定蛋白质之间的作用以及药物靶点，进而开发新的抗病毒药物。
此外，酵母双杂交也可以用于研究提供最终产物的基因，以及了解某种特定基因表达所需的调控因子。
结论总之，酵母双杂交原理是一种可以检测不同蛋白质间功能关系的分子生物学技术，目前它已被广泛应用于分子生物学研究和药物开发中，以及研究调控细胞过程。
未来，这种技术将会进一步完善，为生物学研究和药物开发带来更多的希望和机遇。
《酵母双杂交自激活》课件
利用酵母双杂交自激活技术揭示疾病 发生和发展过程中蛋白质相互作用机 制，为疾病诊断和治疗提供新思路。
利用酵母双杂交自激活技术检测生物 安全威胁和生物防御，为公共卫生安 全提供有力保障。
药物发现与筛选
通过酵母双杂交自激活技术筛选潜在 的药物靶点，发现新的药物候选分子 ，加速药物研发进程。
未来研究的方向与挑战
酵母双杂交自激活的实例分
03
析
实验材料与试剂
01 酵母菌株
用于表达不同蛋白的酵母 菌株。
03 重组蛋白
用于构建融合蛋白的蛋白
。
02 培养基
用于培养酵母菌株的培养
基。
04 抗体
用于检测融合蛋白的表达
和相互作用。
实验步骤与操作
构建融合蛋白
将目的蛋白与诱饵蛋白或检测蛋 白融合，构建成融合蛋白。
转化酵母细胞
实验流程
准备实验材料
选择适当的酵母菌株、质粒载体、酶、DNA 片段等。
构建融合蛋白
将目的蛋白与转录激活域或DNA结合域融合， 构建成融合蛋白表达载体。
转化酵母细胞
将融合蛋白表达载体转化入酵母细胞中。
筛选阳性克隆
通过抗生素筛选、PCR鉴定等方法筛选出成功转化 的阳性克隆。
检测报告基因表达
通过β-半乳糖苷酶活性检测、荧光素酶活性检测 等方法检测报告基因的表达水平。
THANKS
感谢观看
结果判断
根据实验结果，判断融合 蛋白之间是否存在相互作 用。
讨论
对实验结果进行深入讨论 ，分析可能的影响因素和 实验误差，提出改进措施 和未来研究方向。
酵母双杂交自激活的未来发
04
展与展望
酵母双杂交自激活技术的改进与创新
酵母双杂交原理和具体流程
酵母双杂交原理和具体流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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酵母双杂交是一种利用酵母遗传学方法来研究蛋白质相互作用的技术。
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附件1：大学生科研兴趣培养计划项目申报书项目名称项目负责人学院联系电话申报日期四川农业大学制表项目名称起止时间年月至年月负责人姓名年级所在学院、专业联系电话E-mail项目组成员导师姓名职务/职称通讯地址电话E-mail一．立题依据玉米是世界上第三大粮食作物，我国的种植面积约2530万hm2，2009-2010年度中国玉米产量1.655亿吨[1]，成为世界上第二大玉米生产国。
1996年前，我国玉米的种植面积仅小于水稻和小麦，居第三位；1996年后，玉米总产量和单位面积产量超过小麦居禾谷类作物第二位，同年玉米增产总额在谷类作物增产总额中占40.5%，远高于水稻的26%和小麦的22 %[2]。
玉米不仅是重要的粮饲作物，还是重要的工业原料。
世界上以玉米淀粉为工业原料的工业制品己超过500余种，并广泛应用于食品、医药、化工等行业[3]。
淀粉是玉米籽粒中的主要积累物质，以淀粉粒的形式存在于植物体中，占籽粒总重的70%左右，淀粉也是构成植物王国的主要成分。
玉米淀粉是人类淀粉主要来源之一，也是工业淀粉和以淀粉为原料的深加工产业的主要原料。
美国淀粉加工业95%的淀粉都是玉米淀粉。
全世界淀粉产量为3600万吨，其中的80%以上都是玉米淀粉[4]。
因此玉米淀粉生产工业在整个玉米加工业中占有十分重要的地位，加强高淀粉玉米育种具有显著的社会效益和经济效益。
淀粉生物合成的整个路线见下图：碳源来自叶片通过光合作用合成的蔗糖，然后蔗糖运输到淀粉合成器官-胚乳细胞又转化为1-磷酸-葡萄糖(G-1-P)，如图所示，1-磷酸-葡萄糖穿过细胞膜，进入细胞溶质和造粉体中，依靠腺昔二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，ADPGPPase)，淀粉合成酶(Starch synthase，SS)和淀粉分支酶(Starch branching enzyme，SBE)催化淀粉生物合成[5,6]。
研究表明ADP-葡萄糖是在细胞溶质中合成并通过在造粉体中的腺昔酸转置于造粉体中的。
在植物体内，淀粉合成的直接前体是腺苷二磷酸葡萄糖(Adenosine diphos-phate glucose，ADPG)。
ADPG由ADPGPPase催化合成，一般认为是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。
叶绿体中的ADPGPPase可利用光合作用产生的葡萄糖-1-磷酸合成ADPG，ADPGPPase是一个别构酶，被3-磷酸甘油酸(3-PGA)、二价阳离子Mg2+、Mn2+变构激活，被无机磷(Pi)抑制;同时ADPGPPase活性还受氧化还原势的修饰，还原力强时，二硫键断开，酶被激活。
在某些储藏器官中，特别是禾谷类作物的籽粒中还存在定位于胞质的ADPGPPase，但区别于叶绿体中的ADPGPPase，其酶活性对3-PGA和无机磷不敏感。
这可能是由于单子叶植物的进化引起的，胞质内激活子不敏感的ADPGPPase是为适应胚乳发育的调控需要，同时为了协调光合作用与淀粉合成途径保留着的造粉体内激活敏感的ADPGPPase;也可能由于位于胞质的ADPGPPase可减少造粉体中ATP的产生和PPi循环。
在玉米胚乳细胞中，ADPGPPase活性主要位于细胞质中，只有少部分(10%)位于造粉体内[7]。
植物的ADPGPPase是由大、小亚基组成异四聚体，根据其在细胞内的分布，分为胞质型(cytosolic)和质体型(plastidia1)两种[8]。
因此，在植物细胞内AGPase存在着4种亚基：即胞质型小亚基(cytosolic small subunit，SSUⅠ)、质体型小亚基(plastidial small subunit，SSUⅡ)、胞质型大亚基(cytosolic large subunit，LSUⅠ)和质体型大亚基(plastidial large subunit，LSUⅡ[9]。
小亚基起催化作用，而大亚基则发挥别构效应[10]。
大亚基为调节亚基，而小亚基为催化亚基[11]。
小亚基行使AGPase的代谢功能，大亚基则承担AGPase 小亚基代谢活性的调控，变构因子诱导的变构调控是AGPase主要的调控形式)；许多单子叶和双子叶植物AGPase 组成亚基不同“等型体”(isoformas )的编码基因cDNA和gDNA已分别从中克隆，其中绝大多数AGPase小亚基由单个基因编码，大亚基则是由多个基因编码的。
不同物种间编码亚基的基因在表达数目和模式方面存在相当大的差异，即使同一物种，不同组织器官大小亚基表达也具有特异性。
迄今为止，在已研究的植物种类中，包括拟南芥、马铃薯、大麦、水稻以及小麦等，它们的AGPase的大亚基同属多基因编码。
国内外有关AGPase的研究较少，关于AGPase的作用模式了解不够深入。
在玉米中AGPase的亚细胞定位鲜有报到，通过酵母双杂交系统研究体内AGPase亚基的组成形式更是种创新。
由于AGPase组成模式及组织表达特异性研究对淀粉合成代谢网络机制的研究有很重要意义，因此有必要要进行此次研究。
本实验的目的及拟解决的问题：体外克隆表达编码玉米AGPase的六个基因，利用酵母双杂交系统研究其组成模式，并通过酶联免疫技术对玉米中AGPase进行亚细胞定位。
此研究将深入阐述AGPase的功能特性，为进一步从生理学和细胞生物学角度深入解析淀粉合成代谢网络机制做好基础，同时也为高淀粉含量玉米品种的选育提供参考。
参考文献：[1]中国行业研究网. /doc/70300/475123.html. 2009-10-8.[2]刘纪麟. 玉米育种学[M]. 北京: 中国农业出版社, 2000.[3]杜何为，黄敏，张祖新. 玉米DNA的小量快速提取[J]. 玉米科学,2004, 12(2): 114-115.[4]尤新编著.玉米深加工技术[M].北京:中国轻工业出版社，2000.[5]Mu-Forster C, Huang RM, Powers JR, et al. Physical association of starch biosynthetic enzymes with starch granules of maize endosperm: Ganrule-ass.Ociated forms of starch synthase I and starch branching enzyme. Plant Physiol, 1996, 111: 821-829.[6]Myers AM, Morell MK, James MG，et al. Rccent Progress toward understanding biosnythesis of the amylopectin cystal. Plant Physiol, 2007, 122: 989-997.[7]Sikka, Choi SB, Kavakli IH, et al. Subcellula: compartmentation and allosteric regulation of the rice endosperm ADP glucose pyrophosphorylase. Plant Sci, 2006, 161: 461-468.[8] Morell MK, Bloom M, Knowles V, Preiss J. Subunit structure of spinach leaf ADPglucose pyrophosphorylase [J]．Plant Physiol, 2004, 85: 182-187.[9] Tetlow I J，Morell M K，Emes M J．Recent developments in understanding the regulation of starch metabolism in higher plants[J]. J Exp. Bot, 2004, 55(406): 2131-2145.[10] Johnson PE，Patron NJ, Bottrill AR, et a1. A low-starch barley mutant，Risaφ16, lacking the cytosolic small subunit of ADP-Glucose pyr0phosphorylase，reveals the importance of the cytosolic isoform and the identity of the plastidial small subunit [J]. Plant Physiol, 2006, l31: 684-696.[11]Smith AM, Denyer K, Martin C. The synthesis of the starch granule. Annu Rev Plant Physiol Plant Mot Biel, 2005,48: 67-87.二、项目方案1 试剂材料菌种与质粒：大肠杆菌、酵母菌、T克隆载体、PET表达载体、质粒pGADT-7、pGBKT-7、pGADT7-T、pGBKT7-53、pGBKT7-Lam pMD18-T。
玉米骨干自交系R-08各类PCR引物DNA 主要试剂和药品：限制性内切酶、yDNA/EcoRI+Hind1IMarker, DL2000Marker,T4连接酶, TaKaRa Taq酶、碱性磷酸酶CIP ；PC R纯化试剂盒和DNA胶回收试剂盒；酵母双杂交试剂 ；尼龙膜；小鼠抗BD 的单克隆抗体；其余试剂和药品均为国产分析纯试剂和药品。
常用培养基：LB 培养基、BG-11培养基、YPD 培养基、SD 培养基。
常用溶液：碱变性法提取质粒用液、植物DNA 提取用液、琼脂糖凝胶电泳用液、SDS-PAGE 凝胶电泳用液、Western 印迹法用液、酵母双杂交试剂、蛋白分离纯化等。
常用仪器：台式高速离心机、台式高速冷冻离心机、PCR 仪、多用电泳仪、电子分析天平、水浴恒温振荡器、超声破碎仪、凝胶成像分析系统、分光光度计、核酸蛋白质分析仪、发酵系统、微孔板阅读仪、蛋白电泳系统。
2 技术路线从玉米胚乳和叶片中克隆AGPase 基因。
使用clontech 公司的酵母双杂交试剂盒，将这些基因构建到酵母双杂交表达载体中。
利用酵母双杂交，筛选阳性菌株，克隆鉴定，并通过测定β-半乳糖苷酶活性来确定起结合的强弱程度。
同时将六个基因进行原核表达，分离纯化蛋白，免疫制备抗体。
植物组织蛋白提取，进行免疫印记反应。
2.1 酵母双杂交技术路线植物RNA 提取六个目的片段获得转化酵母AH109菌株转化酵母Y187菌株 三个片段连接文库载体目的片段转化T 载体克隆阳性菌株鉴定三个片段连接到诱饵载体 酵母双杂交2.2 免疫印记技术路线3．研究方案：3.1 酵母双杂交试验3.1.1酵母感受态细胞制备(按照clontech 公司YeastmakerTM transformation system2 protocol 操作)：a 将酵母菌 Y178菌种划线接种于YPDA 平板上， 30℃培养2~3d 后，长出白色克隆。