生物药物分析第二章_酶法分析

A=A2-A1 根据NADH的吸附系数求得其量,即可求得L-谷氨酸的量
(二）和指示酶反应偶联的定量法
（二）和指示酶反应偶联的定量法
常用在下面两种情况 常用在下面两种情况 E E' （1） S P2 P1 测 指 （2）所用酶的专一性不高 SA E PA' E' PB'' PB' SB SC 测 PC' 指 S与P无法区分
过氧化物酶作为指示剂 过氧化物酶作为指示剂 过氧化物酶 H2O2＋4-氨基安替比林＋酚 有色化合物 （醌亚胶色素） 270～420nm
测定G的量 GA + H2O2 （葡萄糖醛酸） 过氧化物酶 指示酶反应 H2O2＋4-氨基安替比林＋酚 有色物 通过测定270～420nm任一处的A的变化可定出G的量 测定酶反应G＋H2O＋O2 G氧化酶
S S'
酶 P'
P
在单酶反应中，不需指示反应，可以直接测
定S减少量或P增加量和辅酶变化量
1、底物减少量的测定
293nm or 297nm 方法：取试管3支 1 酶对照 尿酸酶溶液
有特征吸收
2 底物对照 硼酸Buff ＋ 待测样品液
3 反应 硼酸Buff ＋ 待测样品液 ＋ 尿酸酶溶液 A3
室温放15min A1 通过测 A293 or
2、使用终点法应注意的问题
酶的底物专一性
1）绝对专一性
2）相对专一性 3）立体异构专一性
对于酶法分析来说，最理想的酶是具有绝对
专一性酶
3、反应的平衡
酶反应平衡十分偏向进行方向，不需进行任何处理 若反应的平衡并不十分偏向进行方向，或偏向逆方 向，通常需采取以下一些措施：
对于双底物反应尽可能提高第二底物的浓度
时间（分）
L-谷氨酸定量 用谷氨酸脱氢酶
L-谷氨酸 + H2O NAD+
[例2] L-谷氨酸的定量测定(NADH生成量的测定)
谷氨酸脱氢酶
-酮戊二酸 + NH4
+
NADH
此反应平衡偏向左方.测定时需设法使反应平衡向右进行 克服的办法: 1 加肼,反应生成 -酮戊二酸可以和肼反应 生成腙,将生成物 -酮戊二酸 除去. 2 提高NAD+的浓度 3 可偶联心肌黄酶 方法: 空白管 肼 + NAD(过量) + 谷氨酸 加NAD后准确60分钟 测340nm吸附值 A1 A2 酶 肼 + NAD(过量) + 谷氨酸 加NAD后准确60分钟 测340nm吸附值
如何测得循环数n？ 用已知量NADH已知作为NADH转在相同条件 下进行循环反应和指示反应
NADH已知=NADH指示/n
n=NADH指示/NADH已知 即已知量NADH已知平行做循环反应，指示反应
酶法分析与酶活力测定的异同
相同点：二者均使用了酶促反应
不同点： 测定的目的物不同，实验设计不同
1）酶活力测定中待测物为酶，因而酶必须 是
限速因素，而底物和辅酶等必须过量
2）酶法分析中待测物不是酶，而是底物或辅酶
或抑制剂或激动剂等等。因而必须使待测物成为该反
应的限速因素
一、终点法(总变量法 )
先借助酶反应（单个酶反应或者几种酶构成的偶联
可用两种酶：甘油酸脱氢酶（专一性强） 乳酸脱氢酶（丙酮酸干扰） 羟基丙酮酸定量 羟基丙酮酸 甘油酸脱氢酶 D-甘油酸
NAD+ NADH+H+ 乳酸脱氢酶 L-甘油酸 羟基丙酮酸 NADH+H+ 方法： 羟基丙酮酸 ＋ NADH+H+ A340 A 加入酶 充分反应后 A1 加酶 A2 比色皿中反应测定 A＝A1－A2 NAD+
表 2-1. 使用终点法（单酶反应）通过辅酶变化量定量测定的主要物质及使用的酶 被测物质 使用的酶 D-6-磷酸葡萄糖醛酸 6-磷酸葡萄糖醛酸脱氢酶（E.C.1.1.1.44） D-半乳糖 丰乳糖脱氢酶（E.C.1.1.1.48） D-山梨糖醇 多元醇脱氢酶（E.C.1.1.1.14） L-赤糖醇 多元醇脱氢酶（E.C.1.1.1.14） L-甘油-3-磷酸 甘油-3-磷酸脱氢酶（E.C.1.2.1.12） L-乳糖 乳糖脱氢酶（E.C.1.1.1.27） 丙酮酸 乳糖脱氢酶（E.C.1.1.1.27） 乙醇 醇脱氢酶（E.C.1.1.1.1） 乙醛 醇脱氢酶（E.C.1.1.1.1） 二羟醋酸 二羟醋酸还原酶（E.C.1.1.1.26） 异柠檬酸 异柠檬酸脱氢酶（E.C.1.1.1.42） α -酮戊二酸 谷氨酸脱氢酶（E.C.1.4.1.3） L-苹果酸 苹果酸脱氢酶（E.C.1.1.1.37） 草酰乙酸 苹果酸脱氢酶（E.C.1.1.1.37） L-丙氨酸 丙氨酸脱氢酶（E.C.1.4.1.1） 氨 谷氨酸脱氢酶（E.C.1.4.1.3） 丙二酰-CoA 脂肪酸合成酶 醇脱氢酶（E.C.1.1.1.1） NAD 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（E.C.1.1.1.49） NADP 谷氨酸脱氢酶（E.C.1.4.1.3） NADPH(NADH) UDP-葡萄糖 UDP-葡萄糖脱氢酶（E.C.1.1.1.22）
指示酶反应
1、以脱氢酶为指示剂
E
1.以脱氢酶为指示剂 测定酶反应：S P1 测定酶反应的产物P1作为以NAD或NADP为 辅酶的某一脱氢酶的底物，将两个酶促反应 相偶联。 指示酶反应： P1 P2 NAD NADH NADP NADPH
葡萄糖 -1磷酸（ ）的定量 葡萄糖 -1-G-1-P 磷酸（ G-1-P）定量 [例1]
（三步） 第一步：转换反应： PG＋NAD
+
生成与待测组分相当的定量循环底物
PG脱氢酶 正比 PG 1、5-脱羧-PG＋NADH＋H+ NADH转
NADH转
可作循环底物
第二步：循环反应
PG＋NAD
1、5-脱羧-PG＋NADH＋H+ 第二步：循环反应：生成的循环底物反复参 NADH转 正比 PG NADH转 加由两个酶反应组成的偶联反应，所得产物 可作循环底物
G-6-P 脱氢酶 6 P GA 指示酶反应：G-6-P NADP+ NADPH+H+ 方法：Buff＋NADP＋样品（G-1-P）＋脱氢酶 放5分钟 340nm测A1（清除试剂及样品中混入的G-6-P） 向混合液中加变位酶 放4分钟 340nm测A2 测定酶反应：G-1-P 变位酶
2、以脱氢酶以外的酶作为指示剂 2.以脱氢酶以外的酶作为指示剂
+
PG脱氢酶
第二步：循环反应 Glu脱氢酶 -酮戊二酸 Glu NADH+H+ 3- P 甘油酸 NAD+ 3- P 甘油醛 n次循环
量为循环底物的若干倍
3- P 甘油醛脱氢酶 Glu(或3- P 甘油酸） NADH转＝ n
第三步：指示反应：采用酶法测定反应物。 根据反应产物量和循环次数，计算出循环底 物量，然后推算出样品中待测组分的量
1）各种氨基酸和草酸 2）黄嘌呤、次黄嘌呤以及CoA
3、辅酶变化量的测定
条件：测定以NAD或NADP为辅酶的脱氢酶
的底物的量，此法适用范围很广
原理：NADH和NADPH在340nm有特征最大
吸收峰，而NAD和NADP在340nm无吸收带， 故可应用于NAD或NADP为辅酶脱氢酶反应 ，通过测定340nm吸光度变化，对作用相应 脱氢酶底物的物质进行定量分析
酶反应）使被测物质定量地进行转变，然后在转变
完成后，测定底物、产物或辅酶物质（第二底物）
等的变化量
终点法是酶法分析中最普遍，最广泛的定量法
1、终点法的条件
必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得 到它的制品
能够确定使这种酶反应接近进行完全的条
反应中底物的减少或产物的增加或辅酶物质 的改变等可以借助某种简单的方法进行测 在能满足这些条件的情况下，最好是采用单 一酶反应就能进行定量检测
ΔA/Δt）成正比
标准曲线法
管号
标准肝素溶 液（ml）
0
标准曲线 1 2 3
4
5
样品的测定 1 2
待测样 品(ml)
0 2 1
1
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 1
1
Δt1
1.0 1.0 1
1
Δt测1
1.0 1.0 1
1
Δt测2
H2O(ml) RNA(ml)
此法仅循环靶物质，减少了样品中存在的其它 物质对测定的干扰，不需要对样品进行预处理 或对靶物质的提取，且该法不需要专门的设备 酶循环放大分析法定量限度达10-15～10-18mol
酶循环放大法步骤
第一步：转换反应
酶循环放大法的原理、步骤（超微量前列腺素的定量为例）
以样品中的待测组分为底物，经特异反应
对氧化还原之类与H＋有关的反应要选择适当的pH
设法除去产物
用具有不同平衡常数的辅酶类似物代替原有的辅酶
和第二底物的再生系统偶联，则第一底物可能完全 转化为反应产物
4、反应液中的酶量
对于单酶反应的酶法分析：所加入的酶量（
u/ml）相当于Km（mmol）
对于偶联反应的酶法分析，所加入酶量如下：
1）第一反应为酶量（u/ml）相当于Km1（mmol）
FMN（黄素嘌呤单核苷酸） FAD（黄素嘌呤二核苷酸）
乳酸氧化酶 氨基酸氧化酶
TPP（焦磷酸硫胺） 丙酮酸脱羟酶 P 吡哆醛 谷草转氨酶 P 吡哆胺
2、抑制剂的测定 S
例：肝素的测定
肝素
RNA
E
抑制剂
P
抑制剂的量与反应速度的下降值成正比
RNAs
紫外有吸收
e
小分子
无
肝素量与反应速度的下降值（V=
（－）
S + ATP 丙酮 酸
S激 酶
P ＋ ADP 磷 酸 烯醇 或丙酮 酸
丙酮 酸 激 酶
反应速度法
下列情况使用反应速度法：
1）很难得到专一地作用并定量转化被测物
质的酶或偶联指示酶时
2）被测物及其微量时 使用速度法可对S、抑制剂、激动剂、辅酶等 定量
第二节、酶法分析的类型与操作步骤
一、终点法的种类 （一）单酶反应定量法：
2）第二反应为酶量（u/ml）相当于（1～2）
×Km2（mmol）
物抑制
5、反应产物抑制 物对反应本身有抑制作用，则就会妨碍反应进行 取将该产物除去或者和再生系统偶联的办法解决 酶促反应的产物对该反应存在抑制作用，应 反应生成的 ADP 往往能抑制该反应，但此时若在 采取去除该产物或用再生系统偶联的办法加 7.1.40 ）偶联，使 ATP 再生。 以解决
心肌黄酶作为指示剂

心肌黄酶
NADH + H +INT(碘代硝基四唑)
L-谷氨酸的定量测定：
测定反应：L-Glu
NAD
+
+ 甲臜
492nm有强吸收
+ NAD + H2O
α-酮戊二酸+
NADH + H
指示反应：NADH
+ INT + H
+
心肌黄酶 NAD
+ 甲臜
+
谷氨酸脱氢酶
A2 A297定量
A=A1+ A2-A3
可定量的物质有：胞嘧啶（280nm）、腺嘌 呤（280nm）和尿酸（293nm或297nm）
尿酸＋2 H2O＋O2
尿酸酶
尿囊酶＋CO2 ＋H2O2
2、产物增加量的测定
在以待测物为底物的酶反应中，底物被转变 为具有可进行专一性定量测定的性质产物
此法可定量的物质有（293nm）：
第二章 酶法分析
第一节 概述
基本原理：利用酶的特点，以酶作为分析工具
或分析试剂，用于测定生物药物样品中用一般
化学方法难于俭测的物质，如底物、辅酶、抑
制剂和激动剂(活化剂)或辅助因子含量的方法
酶法分析的特征
适用范围 专一性（选择性） 灵敏度 精确度 迅速程度 简便程度 经济方面 底物、辅酶、激动剂、抑制剂（较窄） 很高，原则上容许类似物同时存在 － 很高，可达到 10 7 摩尔以下，如果和荧光 － 法组合在一起，也可达 10 9 摩尔左右 一般，根据微量吸管误差决定；也取决于 组合的方法 一般，酶反应本身多在 30 分钟以下；通 常不需要进行处理 较差，必须有酶的操作训练（温度、 pH 等的确定很重要） 一般，由于酶用量很微，故不会太贵
RNAse(ml)
1
1
Δt2
1
1
Δt3
Biblioteka Baidu
1
1
Δt4
1
1
Δt5
连续测定各管A300值，求出各管ΔA300=0.04所需的时间Δt
Δt0
肝素含量标准曲线
Δtn/Δt0
肝素浓度
根据
Δt测/Δt0计算样品中肝素含量
三、酶循环放大分析法
基本原理：利用酶循环和酶对底物特异性来放
大靶物质（被测物）的测定方法
+
+
二、反应速度法
根据酶在一定pH和温度条件下催化底物（待 测物）反应初速度 在酶反应中除待测物（底物）外，影响反应速 度的其他物质均过量，反应速度则与待测物浓
度成正比关系
当待测物作为某种酶专一辅酶或抑制剂时，则
该物质浓度和酶反应速度之间存在一定关系
辅酶的测定 1、辅酶的测定
[例] D-2、3-二磷酸甘油酸 （2、3-DPG）定量 3- P 甘油酸 P 甘油酸变位酶 2、3-二 P 甘油酸 2- P 甘油酸