单抗纯化手册

为什么在单抗技术在发明二十年之后仍然没有被应用到 人类基因的治疗上，主要原因是因为鼠源抗体被人类免 疫系统识别为外源蛋白，会产生人抗鼠抗体，这不仅使鼠 抗失去效果，而且会造成人体免疫系统混乱。解决这个问 题的方法是用基因工程的手段构建嵌合抗体或人源化抗 体。当抗体被用于治疗制剂时最好有长的半衰期，低免疫 原性，对抗原有高亲和力，这些特性均可用基因工程的方 法获得。现在基因工程抗体表达的类型分为嵌和抗体，移 植抗体，抗体分子片段的表达，抗体融合蛋白及人源性抗 体片段。嵌和抗体是将小鼠单抗可变区与人恒定区基因 连接形成的嵌合基因表达的嵌合抗体分子；移植抗体是 将小鼠抗体的互补决定区序列移植到人抗体的可变区框 架中形成的；抗体的分子片段有 Fab 段，Fv 段及双价抗 体分子片段；抗体融合蛋白是导向抗体与毒素或细胞因 子联合所形成的；人源性抗体片段是 Fab 或 ScFv 与噬菌 体外壳蛋白融合而制备的。
Sample:
Eluted mouse monoclonal IgG from HiTrap Protein G HP
Binding buffer: 20 mM sodium phosphate, pH 7.0
Elution buffer: 0.1 M glycine, pH 2.7
Flow rate: 2 ml/min
另一些类型的免疫球蛋白也可以于 A 蛋白结合如 IgA、
Wood Mackenzie预测治疗性单抗的市场将于2004年达到64亿
美金，每年增长30%。
IgM。
二.单抗的定义和性质
单抗是 B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞杂交形成的杂交瘤细胞 产生的，可以识别和结合特异的抗原。单抗作为一类蛋白 即有共性又有个性，所有单抗的结构是类似的，均由重链 和轻链组成，单抗的分子量如IgG大约均在150000Da (重 链 50 Kda，轻链 25 Kda); 但不同单抗的等电点从 4.0 到 9.5 不等，糖基化程度，疏水程度及电荷密度等生化性质 上各不相同。
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冲液洗涤。或者用含0.1M乙酸及20%乙醇的溶液平衡柱， 工作中也经常碰到。BlueSepharose 介质是去除白蛋白的
静置 1小时，然后用至少 5个柱体积的灭菌结合缓冲液洗 一种方法。二聚体和寡聚体在蛋白浓度较高时容易形成，
涤。或者用70% 乙醇平衡柱，静置12 个小时，然后用至 这些聚合物将降低样品的生物活性，一般来讲凝胶过滤
20%乙醇洗涤柱子和介质 (五个柱体积洗装填的介质)，于 冲液 B
4-8˚C 保存。
5. 收集片段于滴定稀释溶剂中 (如 1.0 M Tris-HCl，pH =
8.0，稀释溶剂的体积等于程序片段体积的 5%)
MabSelect
6. 以5到10个柱体积的100%的缓冲液B对柱子实现再生
MabSelectTM 是一种新的 BioProcessTM 亲和介质，用于填 7. 用缓冲液 A 对柱子再平衡
泡的产生。
CIP 方法因实验样品不同应有所改良。而日常进行 CIP的
Hale Waihona Puke Baidu
理化性质
频率亦取决于样品的性质。不过推荐每5个循环后进行一
组成：高度交连的琼脂糖；
次 CIP 处理。依照污染物的性质采用不同的CIP 程序。如
包装大小：40-130µm (d 50v H85 µm) ;
果污染严重，则需要进一步优化 CIP 手册。
充床层析中可以从大量的样品中分离出单克隆抗体。
* 沉淀或变性的物质：以 2 个柱体积的 6M 胍或者 10 mM
特点 1. 其设计保证一天内可以完成超过10000升高表达发酵样
NaOH or 0.1 M H PO 清洗后，立即以5 个柱体积滤过
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灭菌的结合缓冲液 (pH=7 ~ 8) 洗柱，逆转流动方向
Detection: UV: 0-2.0 AUFS, 5 mm cell, 280nm
pH: measured on 0.5 ml fractions
Sepharose Protein G G 蛋白是一种源自链球菌 G 族的细胞表面蛋白，除此之 外，它还是一种三型Fc 受体。其通过类似于Α 蛋白的非 免疫机制与抗体的 Fc 段结合。像 A 蛋白一样，G 蛋白与 IgG 的 Fc 区域特异性结合，不同的是，相对于几种多克 隆 IgG 及人 IgG 来说，G 蛋白显然是更加强有力的结合者。
Sepharose Protein G由于可以广泛的结合真核生物许多类 型的 IgG而成为了捕捉抗体的极佳选择。其对于抗体IgG 的亲和力超过 A 蛋白，同时又将结合清蛋白的水平减小 到最低，使得产物在量及纯净水平上都有优势。
配体从亲和基质中脱落从来都是一个问题，尤其是在洗
脱条件较为恶劣的时候。在这方面，G蛋白也是有优势的，
污染。
pH=3.0
6. 若样品体积较大，则可以将几个HiTrap Protein G HP柱 实验步骤：
连续地接合起来或者在一个大柱子中装填以松散的介 1. 以 10 个柱体积的缓冲液 A 平衡柱子。
质。
2. 上样 (少量抗体)。
3. 以 5 个柱体积的缓冲液 A 洗柱
保存
4. *以10个柱体积的线性梯度洗柱直至洗液为100%的缓
少 5 个柱体积的灭菌结合缓冲液洗涤。
Superdex 200能有效去除这些杂质。牛免疫球蛋白的污染
问题在单抗纯化中十分显著，一般来说用疏水层析和离
注意
子交换可能会除去此类杂质。白蛋白和转铁蛋白也可用
当使用 70% 乙醇时，需要有特定的规则 (防爆区域及设 离子交换和疏水的方法去除，有一些单抗比它们的疏水
因结构的研究，这对单抗的研究带来机遇和挑战。
Protein A Sepharose 和 rProtein A Sepharose 介质
A 蛋白来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，包含了5个与
IgG 的 Fc 段结合的区域。A 蛋白作为亲和配体被固定于琼
脂糖上，而它的这五个结合区域则空闲出来以便捕捉
IgG。1个固定了的A蛋白分子至少可以结合2分子的IgG。
亲和基质中配体脱落是一个问题，尤其是洗脱条件恶劣 时。A蛋白与琼脂糖介质的多位点结合保证其难以被洗下 脱离柱子，因而在广泛的洗脱条件下可以维持极低的配 体脱落水平。
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rProtein A Sepharose 纯化单抗实例：
Protein G Sepharose 纯化单抗实例：
Column:
HiTrap Protein G HP, 1 ml and HiTrap Desalting
目前天然的和重组的 A 蛋白对于 IgG 的 Fc 段有着相似的
特异性，但是重组的 A 蛋白经改造后含有一个 C 末端半
胱氨酸，使得其以单一位点固定于琼脂糖上，增加了结合
能力。A 蛋白对IgG的结合强度依赖于免疫球蛋白的物种
来源，而其动态结合能力则决定于结合强度及其他因素
(例如上样时的流速)。尽管IgG是人体主要的免疫球蛋白，
配体：重组 A 蛋白 (E. coli);
偶联化学成分：环氧基；
消毒
动态结合能力：约为 30mg 人 IgG/ml 介质；
消毒把微生物对床的污染减小到最低。
化学稳定性：于所有水溶缓冲液中稳定；
用 2% hibitane digluconate 及 20% 乙醇组成的溶液平衡柱
通常所用缓冲液为：100mM H3PO4 (pH 1.6), 子，静置6 个小时，然后用至少5 个柱体积的灭菌结合缓
涤步骤，以免过分减少产量。
4. 用脱盐柱对纯化的IgG片段进行去盐处理或者将其转移 实验条件
至适宜的缓冲液 (见 20 页)。
适宜的缓冲液 (举例)
5. G 蛋白琼脂糖介质的再利用：依样品的天然属性而定， 缓冲液A：0.05M硼酸，4.0M NaCl，pH=9.0
只可在前后样品相同的情况下实现，否则会产生交叉 缓冲液B: 0.05M磷酸钠，0.05M柠檬酸钠，0.3M NaCl，
被认识到，应用到诊断试剂当中。现在单抗主要应用于疾 病的预防，诊断和治疗，生物物质的纯化及蛋白结构功能 的研究。治疗性单抗的市场在新药开发中有逐年增长的 趋势，1997 年单抗的销售额是 50 亿美金, 每年都有 40% 到 50% 的增长，1999 年时销售额翻倍，预计到2003 年会 是 1997 年的十倍可达 500 亿美金，由此可见单抗技术是 生物技术领域燃起的一颗新星。从1997 年至今已批准了 8 种治疗性单抗药物，现在在美国市场上比较著名的单抗 药物如 Rituxan (IDEC/Genentech/Roche)，是嵌合 CD-20 单抗，被 FDA 批准的第一个治疗癌症的单抗药物，治疗 non-hodgkins lymphoma, 1997 年上市，现今以进入 56 个 国家,销售额30亿美金；Herceptin(Genentech), 1998上市， 人源化 HER-2,治疗乳腺癌；Orthoclone OKT3 (Ortho Biotech) 1986,鼠源性单抗，用于器官移植后抗排异；再 有如 Simulect (Novartis), Synagis (Medimmune) R, eoPro (J&J, Centocor, Lilly), Zenapax (PDL, Roche) Remicade (Centocor) 等等。现在大约有100 种单抗在临床实验，这
占整个生物制药总数的一半，其中四分之一的单抗在临
床三期或等候批准。单抗发展的趋势从100%的鼠源性单 三.安玛西亚公司单抗纯化用产品
抗到嵌合抗体到人源化单抗最终到完全人源单抗，2000 Sepharose protein A, Sepharose protein G, MabSelect
年年中人类基因序列初稿完成，接下来就是对蛋白和基
单抗纯化手册
一.前言
单抗作为治疗癌症的候选药物主要机制分两类，一类是
1975 年 Kohler 和 Milstein 发明了单抗技术，他们因此在 直接诱导癌细胞凋亡或抑制癌细胞生长或代谢；另一类 1984 年获得诺贝尔奖。但直到1987 年单抗技术的价值才 通过补体效应或 ADCC 来间接杀死癌细胞。
它与琼脂糖介质有许多结合位点，如此紧密的结合力把
脱落水平减小到了最低。事实上在相当广泛的洗脱条件
下，该介质只有极低水平的配体脱落。
** 鉴于洗脱条件可能十分恶劣，建议将洗脱的单抗片段
收集于中和缓冲液中 (每毫升片段60-200µl 1M Tris-HCl，
pH=9.0) 或用 Sephadex G-25 进行缓冲液交换，以保证得
致抗体失去活性，则应考虑使用 A 蛋白琼脂糖。它的好
推荐 pH 值：工作范围 3-10
处是洗脱条件更加温和。
CIP 操作范围 2-12;
2. 大多数物种及亚类的 IgG 在生理 pH 及离子强度下与 G 推荐流动相速：500 cm/h;
蛋白结合。
热稳定的温度区间：4-40 ˚C;
3. 如果目的蛋白与配体间作用较弱，则应该避免多余的洗 推荐长时间保存条件：4-8 ˚C，20% 乙醇；
品的抗体分离。
* 疏水杂质的洗涤：以2个柱体积的非结合物质离子去垢
2. 在工艺许可条件下有高体积流速，线性流速达
剂洗柱 (如 conc. 0.1%)，立即以至少5 个柱体积的滤过
500 cm/hr。
灭菌的结合缓冲液 (pH=7 ~ 8) 洗柱，逆转流动方向。或
3. 通过定向结合配体及优化了的基质加强了与免疫球蛋白 者以3至4个柱体积的70% 乙醇或30%异丙醇洗柱。立
的结合能力。
即用至少5个柱体积的滤过灭菌的结合缓冲液 (pH=7 ~
4. * 在 BPGTM、FineLINETM、INdEXTM、ChromaflowTM 这
8) 洗柱，逆转流向。
些柱子中填充，其分离能力与所填体积成正比，易于线
性工艺放大。
注意：当使用高浓度有机溶剂时，应采用递增梯度避免气
5. 该介质可以耐受严酷有效的 CIP 操作。
备)
性更强，疏水介质可以使目的蛋白结合而使杂质流穿。
四.单抗纯化策略及注意事项
到片段的 pH 值最终近乎中性。
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注意
10 mM HCl (pH 2)，10 mM NaOH (pH 12)，
1. 大多数免疫球蛋白在 pH 值高于 2.7 (或者更低) 时很难
0.1 M 20% 柠檬酸钠 /HCl (pH 3)，6M
被洗脱下来。因此洗脱条件往往比较恶劣，如果由此导
GuHCl，20% 乙醇，2% 苯甲醇；