美洲黑杨(Populus deltoides Marsh)× 青杨(P.cathayana Rehd.)分子 连锁图谱的构建

美洲黑杨(Populus deltoides Marsh)×
青杨(P.cathayana Rehd.)分子
连锁图谱的构建*
苏晓华张绮纹郑先武张香华
(中国林业科学研究院林业研究所北京 100091)
Stephen Harrish
(英国牛津大学植物系)
摘要利用随机扩增DNA多态性RAPD方法，在美洲黑杨(P.deltoides Marsh)×青杨(P.cathayana Rehd.)3代谱系中分析分子标记，构建出第1张美洲黑杨×青杨分子连锁图谱。

共从300个10-mer随机引物中筛选出79个适合引物，检测出可供构图的分离标记180个。

该图谱由20个连锁群，110个RAPD标记组成。

总图距为覆盖基因组总长度的70.35%，标记间的平均间距为17.27cM.连锁群长度在37.1～189.8，相应标记分别在3～10。

本图谱为杨树抗病、虫和其它性状基因定位提供了框架结构，为实现杨树分子遗传育种迈进了最重要的一步。

关键词分子连锁图， RAPD，美洲黑杨，青杨
CONSTRUCTION OF POPULUS DELTOIDES MARSH ×
P.CATHAYANA REHD.MOLECULAR LINKAGE MAP
Su Xiaohua Zhang Qiwen Zheng Xianwu Zhang Xianghua
(The Research Institute of Forestry, CAF Beijing100091)
Stephen Harrish
(Dept. of Plant Sciences, University of Oxford Oxford OX1 3RB)
Abstract
A molecular linkage map was constructed for P. deltoides Marsh
×P.cathayana Rehd. based on random amplified polymorphic
DNA(RAPD)markers. The mapping pedigree consists of three generations with the F1 produced by interspecific hybridization between a P.deltoides female and a P.cathayana male. Three-hundred random 10-base RAPD primers were screened in amplification reactions using DNA isolated from parents P.deltoides ,P.cathayana and their F1 recombinant inbred population consisting of 4 lines. Of these primers, 180 revealed at least one polymorphic RAPD locus which can be used by mapping. This map identified 20 linkage groups spanning 1899.4 cM(110 RAPD markers) with an average distance of 17.27 cM between markers. Linkage groups ranged from 187.8 to 37.1 cM in length and included from 3 to 10 markers, respectively. This map should facilitate the identification of markers that “tag" genes for pest and disease
resistance and other traits in poplar. This is the first genetic map for
P.deltoides ×P.cathayana and an important step towards the molecular breeding in poplar.
Key words Molecular linkage map, RAPD, Populus deltoides Marsh, P.cathayana Rehd.
杨属是当今世界中纬度地区栽培面积最广、木材产量较高的一个树种［1］。

据世界粮农组织(FAO)统计，欧洲不少人工林由杨树组成［6］。

西欧一些国家以发展杨树来缓解其木材供应紧张的矛盾。

杨树也是我国工业人工林主栽树种之一，目前中国杨树人工林占全国人工林总面积的
1/5，是世界各国杨树人工林总面积1.4×106hm2的4倍。

杨木不仅是用材林中纸浆材好原料，好适合于胶合板材和包装箱材的加工利用。

因此，杨树将对缓解世界森林资源渐趋缺乏、木材供需矛盾尖锐起着非常重要的作用。

杨树在常规和分子遗传操作方面要比其它树种简单，种间杂交和无性繁殖容易，并已建成了完善的组培苗生产系统。

杨属所有种的染色体数均为2n=38［4,8］，核基因组相对较小(2n=1.2pg)。

杨树种间多态变异高，一些杨树种较容易进行基因转导［12，13］。

因此，杨树是公认的林木生物学研究的模式树种。

由于杨树种间杂种具杂种优势，因此进行杨树种间杂交非常重要。

目前，杨树许多种间杂种已在世界不少国家和地区占有重要经济地位［21］。

但人们发现许多具有优良特征的个体杂交后在F
1
中的性状表现为中间型，优良特性的获得只能通过间接方式产生。

为了提供重要特征的最佳结合有必要进行性状遗传的深入研究。

杨树遗传图谱将利于了解杂种优势的遗传基础、提供种间杂交不亲和发生程度和特性在下一代遗传方式的信息。

杨树是我国林木中研究较早、较系统的树种。

许多种间杂种，尤其是黑杨派和青杨派杂种已在生产中获得较大的社会和经济效益。

该
研究将以美洲黑杨×青杨所产生的F
1和F
2
为材料，采用分子标记(RAPD)
方法绘制遗传连锁图谱，为目的基因定位和克隆提供框架结构，为进一步数量性状基因位点(QTL)定位，分子标记辅助选择(MAS)奠定基础。

1 材料与方法
1.1 植物材料
中国林业科学研究院林业研究所黄东森研究员在1978年以美洲黑杨(P.deltoides Marsh)(引自罗马尼亚，1965年)为母本，青杨
(P.cathayana Rehd.)(采自北京涧沟)为父本杂交产生了大量F
1
代杂种。

黑龙江省防护林研究所从部分杂种为当地选出几个优良新品种。

1996年，我们利用由黑龙江省防护林研究所提供的中黑防3号(♀)(暂定名)
与中黑防1号(♂)杂交产生F
2
代近1000个单株，建立了美洲黑杨×青
杨F
2
构图植物群体。

构图群体样本按分层抽样方法产生。

首先按当年生
长量将F
2
群体划分为高、中、低和极低4个类群，再在每个类群中分别
随机抽取20个单株，即以F
2
80个个体作为构图群体样本。

亲本美洲黑
杨和青杨及其F
1和F
2
均栽植于中国林业科学研究院苗圃。

1.2 DNA提取
取0.1g鲜叶片于液氮中研成粉末，将研好的粉末转移到1.5mL消毒过的离心管中，加600μL 2×CTAB缓冲液(5mol/L NaCl,10%CTAB,mol/L
O),在60℃下水浴30min，Tris-HCl pH 8.0,0.5mol/L EDTA,βM EE;dH
2
期间要倒转离心管数次。

加600μL氯仿/异戊醇(24∶1)，倒转离心管，使之成为乳状液，在常温下离心15min，将上清液移到新管中。

再重复离心1次。

吸出含DNA的相加0.1体积的NaAC和2个体积95%冷酒精，在-20℃冰箱中保持60min后，再在4℃条件下离心15min，将液体倒出，加1mL70%冷酒精，在4℃下离心10min，将液体尽可能倒出，气干后加适量TE溶解。

1.3 RAPD分析
10-mer随机引物(kits OP-A-OP-M,OP-N,OP-X)购自Operon公司。

3.5mmol/L;4种核
RAPD扩增反应的总体积为25μL,其中包括MgCl
2
苷酸各为0.2mmol/L;引物0.2μmol/L;模板DNA 20ng;Tag酶0.75单位(Smartlong公司)。

反应程序如下：95℃预变性5min,然后进入循环；94℃变性1min,36℃复性1min,72℃延伸2min,共45个循环，最后在72℃延伸10min,结束后保存在4℃条件下。

PCR仪为Perkin Elmercetus DNA Thermal Cycler 480。

扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，紫外灯(MP+4)下观察，拍照。

1.4 分离标记
群体标记是否符合3∶1分离比例。

利用卡平方(X2)检验F
2
1.5 连锁分析与图谱构建
采用MAPMAKER version 3.0b软件，在PC586计算机上进行F
群体
2
的图谱构建。

利用两点测验，推测可能的连锁群：计算所有成对座位的重组率和最大LOD值，推测可能的连锁群，要求LOD值≥2.0，r重组率≤0.4。

然后，对每个连锁群中的标记作多点分析，并采用Kosambi函数，将重组率转换成图距单位(Cetimorgan, cM)。

对于小的连锁群，直接采用Compare命令，选择具有最大似然值(Loglikelihood)的排列顺序构建连锁框架图；对于较大的连锁群，先用两点测验的方法，计算任意两两标记间的LOD值，选择具有较大LOD值的标记，采用Compare命令，推测其最佳排列顺序，建立基本框架。

然后采用try命令，依次将其它的标记放入到框架中的每个空间，寻找出每个标记的最佳位置，具有最大似然值的排序即是该标记的最佳位置。

2 结果与分析
2.1 引物筛选
有效地进行引物筛选(图1)。

按1个亲本有片以2个亲本和4个F
1
代样本有或无此片断推知多态位点及其等位情断、另1个无此片断及F
1
况(纯合或杂合)。

在被筛选的300个引物中，有5个引物(占1.7%)没有产生任何扩增产物，216个引物(占72.0%)没有检测出多态性标记，79个引物(占26.3%)产生至少1个RAPD多态性标记。

Grattapaglia等(1994)［10］在利用RAPD构建桉树图谱中，引物筛选的比率与本项结果类似。

图1 10-mer随机引物筛选
Fig.1 Screening arbitrary 10-base primers
用引物A
01(A)、H
01
(B)和N
01
(C)对亲本P
1
(P.deltoides Marsh)和
P 2(P.cathayana Rehd.)及F
1
4个(Z
3
,Z
1
,Z
2
,Z
4
)个体基因组DNA进行RAPD
分析。

图中a,b,c,d,e,f,g为多态性RAPD标记，M为1-kb DNA标记分
子量。

Primer A
01(A)、H
01
(B) and N
01
(C) were used in RAPD assays with genomic
DNA of the parents P
1(P.deltoides Marsh) and P
2
(P.cathayana Rehd.)
and a progeny sample of 4 F
1(Z
3
,Z
1
,Z
2
,Z
4
) individuals. Segregating
informative RAPD markers are indicated by a,b,c,d,e,f, and g. M is a 1-kb DNA ladder size standard.
2.2 亲本的多态性检测
在所使用的300个引物中，绝大多数引物都有扩增产物，引物最多可扩增片断可达15条，最少的为4条，共计有扩增带近3510.5条。

RAPD 标记是显性标记，一般来说，RAPD分析中的1条谱带即代表其基因组的1个位点，这就意味着本次研究对美洲黑杨×青杨杂种近3510.5个位点进行了检测。

在实验所用的300个随机引物中，有79个引物可揭示两亲本间的多态性，频率为26.3%。

这种多态性表明两亲本在基因组水平上的差异是存在的。

在总共统计的3510.5条片断中，有3301.5条为两亲本所共有，也进而说明二者在种系发生的亲源关系有一定距离。

另外，亲本美洲黑杨具有生长快、抗病强、材质优良等性状；青杨抗病差、抗寒强等特性，这将使建成的遗传图谱能直接用于杨树性状的基因定位和遗传育种。

2.3 RAPD标记分离比的检测
用筛选出的79个引物对构图F
2
群体样本进行扩增，共记录了180
个RAPD标记的分离(表略，图2)。

构图群体标记分离数占亲本多态性标
记的82.9%。

F
2
多态分离标记来自母本美洲黑杨的为42.7%，来自父本青
杨的57.3%，表明F
2群休略偏父本青杨。

这在对F
2
表型遗传变异研究中
亲父本型个体频率略高于亲母本型个体频率的结果一致。

上述结果说明青杨对后代贡献率大，遗传力高。

青杨之所以遗传力高，主要是因为青杨比美洲黑杨系统进化原始所致。

RAPD标记为显性标记，从理论上来说，同一位点RAPD标记的正常分离比应为3∶1。

180个位点标记分离经卡平方(X2)测验表明，本研究中的绝大部分RAPD标记符合3∶1分离比率，25个标记分别在0.05和0.01水平上表现出显著和极显著的偏分离，占分离标记总数的13.3%。

标记的偏分离现象在其它林木中也是比较普遍的，而且，一般偏分离的标记比较多。

Bradshaw等(1994)［5］利用美洲黑杨(Populus deltoides )×毛果杨(P.trichocarpa)杂种构图中RAPD标记异常分离的为14%，比本研究结果略高一些。

图2 引物H
01的RAPD标记在F
2
群体中的分离
Fig.2Segregation of RAPD fragments amplified with primer H01 in the F2
population
2.4 连锁分析与图谱构建
本项进行连锁分析的RAPD分子标记共180个。

在林木和草本科植物构图中，一般对不符合孟德尔遗传分离规律的标记不纳入加锁分析，但利用偏分离比率标记构图的也很多。

如在林木中，Bradshaw等(1994)在杨树构图和Grattapaglia等(1994)在桉树构图中都用了偏分离的RAPD 标记。

本项研究为构建覆盖杨树基因组尽可能大的遗传图谱，把偏离比率的RAPD标记也一起用于构图。

采用MAPMAKER Version 3.0b软件，设置最大重组率为0.4和最小LOD值为2.0将180个RAPD标记通过两点连锁分析，确定各标记的连锁关系，结果有110个标记被分配到23个连锁群。

在180个标记中有58个标记则未连锁到任何一个连锁群中，未被连锁的标记占标记总数的近1/3，这在其它树种遗传图谱构建中也较常见。

在25个偏分离比率的RAPD 标记中，有半数标记未进入连锁群。

Bradshaw等(1994)把16个严重偏离比率的标记(14%)用于杂种杨构图，结果只有3个没能被连锁到连锁群上，认为偏离比率标记与符合孟德尔分离标记同样可用于构图。

将6个由2个标记组成的连锁群排除，只对其余较大的17个连锁群标记用于多
点连锁分析。

由于连锁群1和连锁群4标记较多，无法直接采用Compare 命令排序，首先根据连锁的紧密程度，将连锁群1分为3个亚群，连锁群4分为2个亚群，然后先用两点测验的方法，计算任意两标记间的LOD 值，选择具有较大LOD值的标记，采用Compare命令，推测其最佳排列顺序，建立基本框架。

然后采用try命令，依次将其它的标记放入到框架中的每个空间，寻找出每个标记的最佳位置。

通过以上分析最终产生由20个连锁群110个RAPD标记组成的框架图(图3)。

杨树染色体2n=38,理论上应为19个连锁群。

但由于标记数量有限，有些连锁群往往由于中间一些标记距离较远，在作图时易造成断裂。

这在其它林木和作物种类的作图过程中是非常常见的。

该图谱总图距为1899.4 cM,有4个连锁群为157 cM或更长，5个小的连锁群标记的数量为3，最长连锁标记间距187.8cM，最短为37.1cM，标记最大图距为40.8cM，最小图距为0.2cM，其平均间距为17.27cM，有1/6区间比10cM要小。

另外58个标记位点独立于连锁群之外，其原因可能是分析的总标记数偏少，难以确定未定位标记与定位标记间的连锁关系。

Bradshaw等(1994)利用Hullber等(1988)［11］方法以美洲黑杨×毛果杨杂种F
估计杨树基因组长度为2400～2800cM，用19条较大的连锁
2
群总长度估计覆盖基因组为48.5%(1261cM/2600cM)。

本研究用同样方法估计图谱覆盖基因组长度为73.05%(1899.4cM/2600cM)。

3 讨论
由于RAPD技术简单、快捷、经济，故被各国学者在树木作图中广泛应用。

目前，在树木中已构成20余个树种的RAPD标记遗传连锁图谱。

如巨桉(Eucalyptus grandis)连锁图谱图距1552cM(240个标记)，覆盖基因组95.8%，平均图距18.5 cM［10］。

欧洲云杉(Picea abies)RAPD图谱总图距3584cM(185个标记)，平均图距22cM［3］。

长叶松(Pinus palustris Mill.)图谱总图距为1635cM(133个标记)，平均图距22cM［17］。

短叶红豆杉(Pacific taxus brevifolia yew)图谱总图距为305.8cM(41个标记)［9］。

本项所获的美洲黑杨×青杨杂种RAPD图谱比较来看总图距及平均图距都还是不小的。

虽然目前我们构成的图谱标记数量有限，但它毕竟是第一张美洲黑杨×青杨3代谱系产生的分子连锁图谱，它可作为杨树基因组研究的基础，为目的基因定位提供了框架结构，为实现杨树分子遗传育种迈进了最重要的一步。

采用哪种标记构图都有其优缺点。

RAPD除具有上述优点外，相对其它标记还可探测更多的多态性位点，因此用其构图更有效。

Menendz等(1997)［15］以Cowpea构图研究得出，平均每2个RAPD就可探测出1个多态性标记，而RFLP每4个探针还探测不出1个多态标记，AFLP 17个结合引物仅能探测出4个多态标记。

另外，RAPD标记在基因组中探测是随机的，因此标记在图谱上的分布也较均匀。

陈洪等(1995)［2］用62个RAPD 标记就建成了一张在遗传图距上连续的(相邻标记的最大图距一般不超过30cM)连锁图。

本项研究也证实了这一点。

RAPD进行基因组构图也有一些缺点：(1)对于野生树种为了获得显性RAPD位点进行有效构图，必须进行测交或回交，这对野生树种来说是很困难的；(2)由于单一引物可
扩增出几个位点，所以在相关树种图谱间位点同源分析可能有问题；(3)由于在不同实验室构图群体和使用的循环仪不同，不同实验室的结果没有可比性［14］。

另外，由于亲本群体数量有限，一些已归于1个亲本的等位点，实际上在其它亲本中也可能存在，但在我们的研究中没有探测到。

最后，由于RAPD仅能提供显性标记，对等位基因单拷贝个体和双拷贝个体不能定量区分开。

因此，用显性标记构图，标记连锁相斥，即连锁基因在不同染色单体上分别遗传。

在遗传距离估测时，染色单体上的标记提供的信息量较小。

所以用显性标记构图时，采用偶合连锁标记是必要的。

遗传模拟表明，在构图中，用显性偶合连锁标记与用共显标记一样有效［19］。

随着多种遗传标记方法的逐步完善和发展，人们正在努力探索综合应用多种遗传标记进行基因组研究。

在树木中，已有相应的图谱构成［5，7，16］。

如Bradshaw等(1995)以毛果杨(P.trichocarpa)与美洲黑杨(P.deltoides )杂交3代谱为材料，利用3种分子标记RFLP、STS和RAPD 构建由343个混合标记(RFLP 215个，STS 17个，RAPD 111个)组成的遗传连锁图，总图距为1261cM覆盖率为48.5%［5］.我们也正在进行这方面尝试，力争在短期内构建出由多种标记组成的更高密度的美洲黑杨×青杨分子连锁图谱，为实现杨树分子育种奠定基础。

图3 美洲黑杨(Populus deltoides Marsh)×青杨(P.cathayana Rehd.)
遗传连锁图
Fig.3 Genetic linkage map of P.deltoides M arsh×P.cathayana
Rehd.
参考文献
1 徐纬英主编.杨树.哈尔滨：黑龙江人民出版社，1988
2 陈洪，朱立煌，徐吉臣等.RAPD标记构建水稻分子连锁图.植物学报，1995，37(9)：677～684
3 Binelli G, Bucci B.A genetic linkage map of Picea abies Karst., based on RAPD markers, as a tool in population genetics. Theor. Appl. Genet., 1994,89:167～178
4Bradshaw H D, Stettler R F. Molecular genetics of growth and development in Populus. I.Triploidy in hybrid poplars. Theor. Appl. Genet., 1993,86:301～307
5Bradshaw H D, Jr, Villar M. Molecular genetics of growth and development in Populus. lll.A genetic linkage map of a hybrid poplar composed of RFLP, STS, and RAPD markers. Theor. Appl. Genet., 1994,89:167～178
6Cervera M T, Gusmao J and Stenackers M et al. Identification of AFLP molecular markders for resistance against Melampsora larici-populina in Populus, Theor. Appl. Genet., 1996,93:733～737
7Devey M E, Bell J C, Smith D N et al. FA genetic Linkage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD and microsatellite markers, Theor. Appl. Genet., 1996,92(6):673～679
8Dhillon S S. DNA in tree species. In: Bonga JM, Durzan DJ(eds). Cell and tissue culture in forestry vol l.Martinus Nijhoff Pub, Dordrecht, The Netherlands, 1987,298～313
9Gocmen B, Jermstad K D, Neale D B et al. Development of random amplified polymorphic DNA markers for genetic mapping in Pacific yew (Taxus brevifolia). Can. J. For. Res., 1996,26:497～503
10Grattapaglia D, Sederoff R. Genetic linkage maps of Eucalyptas grandis and Eucalgptus urophylla using a pseudo-testcross: Mapping strategy and RAPD markers. Genetics, 1994,137:1121～1137
11Hulbert S H, Ilott T W, Legg E J et al. Genetic analysis of the fungus, Bremia lactucae, using restriction fragment length polymorphism. Genetics, 1988, 120:947～958
12Jouanin L, Brasilerio A C M, Leple J C, et al. Genetic transformation: a short review of methods and their applications, results and perspectives for forest trees. Ann. Sci. For., 1993, 50:325～336
13Leple J C, Brasileiro A C M, Michel M F et al. Transgenic poplars: expression of chimeric genes using four different constructs, Plant Cell Rep., 1992,11:137～141
14Loren H R, Hichang C, Ray C et al. Genomic map of a diploid hybrid species, Heredity, 1993,70:285～293
15Menendez C M, Hall A E and Gepts P. A genetic linkage map of cowpea (Vigna unguiculata) developed from a cross between two inbred, domesticated lines. Theor. Appl. Genet.,1997,95:1210～1217
16Mukai Y, Suyama Y, Tsumura Y et al. A linkage map for sugi (Cryptomeria japonica) based on RFLP, RAPD, and isozyme loci.
Theor.Appl.Genet., 1995,90:835～840
17Nelson C D, Kubisiak T L, Stine M et al. A genetic linkage map of longleaf pine (Pinus palustris Mill.) based on random amplified polymorphic DNAs. J. Hered., 1994,85:433～439
18Reiter R S, williams J G K,Feldmann K A et al. Global and local genome mapping in Arabidopsis thaliana by using recombinant inbred lines and random amplified polymorphic DNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992,89:1477～1481
19Scott V T, Joseph P T. Genetic analysis with random amplified polymorphic DNA markers. Plant Physiol., 1993,101:349～352
20Tulsieram L K, Glaubitz J C, Kiss G et al. Single tree genetic linkage mapping in conifers using haploid DNA from megagametophytes. bio/Tech., 1992,10:686～690
21Zsuffa L. A summary review of interspecific breeding in the genus Populus. In: Fowler DP, Yeatman CW (eds) Proc. 14th Meet.Can.Tree Improv. Assoc. part 2. Fredericton N.B., 1975,107～123
本文于1998年5月19日收到。

*本项研究为林业部指南项目“杉木、杨树遗传图谱构建及数量性状位点(QTL)定位研究”和国际林业研究中心牛津大学研修项目“杨树遗传图谱构建研究”。

本项研究得到南京林业大学黄敏仁教授指教和中国科学院遗传研究所何平博士帮助，在此一并致谢。

参加该项实验工作的人员还有卜祖娴和李金花。