分离技术
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分离技术
生物制药工艺学第四章到第十一章
第四章 固相析出分离法 改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术 称为固相析出分离法。析出物为晶体时称为结晶；析出物 为无定形固体称为沉淀法。固相析出法主要有盐析法，有 机溶剂沉淀法，等电点沉淀法，结晶法等。 盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通 过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以 沉淀析出，达到纯化目的的方法。 盐析的机制：高浓度的中性盐溶液中存在着大量的带电荷的 盐离子，它们能够中和生物分子表面的电荷，使之赖以稳 定的双电层受损，从而破坏分子外围的水化层；另外，大 量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，从另一方 面摧毁了水化层，使生物分子相互聚集而沉淀。
第五章 吸附法 吸附是物质分子在两相界面上浓度的增加。 由于界面上的分子同时受到不相等的两相分子的 作用力，因此界面分子的力场是不饱和的，即 存在一种固体的表面力，它能从外界吸附分子、 原子或离子，并在吸附剂表面附近形成多分子 层或单分子层。我们称物质从流动性（气或液 相）浓缩到固体表面从而达到分离的过程称为 吸附作用。把在表面上能发生吸附作用的固体 称为吸附剂；将被吸附的物质称为吸附物。
预处理
上样
吸附
洗杂
洗脱
再生
常用吸附剂： 1)活性炭是一种吸附能力很强的非极性吸附剂，其吸附作 用在水溶液中最强，在有机溶剂中较弱，吸附能力的 顺序：水>乙醇>甲醇>乙酸乙酯>丙酮>氯仿。 2)人造沸石 人造沸石是一种人工合成的无机阳离子交换剂。用于细 胞色素C的分离。 3)磷酸钙凝胶 在蛋白质的分离、精制中，较为常用的吸附剂为磷酸钙 凝胶。（羟基磷灰石）活性部位为钙离子。 4)白陶土 5)氢氧化铝凝胶 用于蛋白质及酶的分离。
结晶法 改变溶液的某些条件，使其中的溶质以结晶态析出的过 程称作结晶。 （一）盐析结晶法 这是生化制药中应用最多的结晶方法。其作用是通过向 结晶溶液中引入中性盐，逐渐降低溶质的溶解度使其 过饱和，经过一定时间后晶体形成并逐渐长大。 （二）透析结晶 （三）有机溶剂结晶 （四）等电点结晶 （五）温度诱导结晶
有机溶剂沉淀法 向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶 解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。 主要机理：（1)亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电 常数，使得溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 (2)水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压 缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲 水性，导致脱水凝集。 等电点沉淀法 两性电解质，在溶液pH处于等电点（pI）时分子表面净电 荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏， 分子间引力增加，溶解度降低。调节溶解的pH值，使两性 溶质溶解度下降，析出沉淀的操作。
RS
t R 2 t R1 1 [(Wb )1 (Wb ) 2 ] 2
tR 2 N 5.54 ( ) 2 t 1
2
t0
t R t0 k' t0
k '1 k '2
tR1 tR2
X＋OH－ X＋
Ｘ＋
nX＋ X＋
X＋ X＋
X＋
Z＋
Z＋
X＋
X＋ X＋
X＋
X＋
Y＋
Z＋
Z＋
Z＋ Y＋ X＋ X＋
X＋ Z＋
X＋ Ｘ＋ Z＋ X＋ X＋ Z＋ X＋ X＋ Y＋Y＋
Ｚ Ｚ＋
＋
平衡上样
吸附
洗杂
洗脱
第七章 凝胶层析 它是将样品化合物通过一定孔径的凝胶固定相，用于流 经体积的差异，使不同分子量的组成得以分离的层析。
L 配基 ＋ L
＋
S 样品 L
L
S
配基固定化 L ＋ S L S ＋ 杂质
吸附样品 L S L ＋ S
样品洗脱
第九章 离心技术
沉降作用—悬浮液静置时，在重力作用下，密度大于周 围溶液的固体颗粒逐渐下沉，成为沉降作用。 离心技术—在离心力场作用下，加速悬浮液中固体颗粒 沉降速度的方法称为离心技术。 相对离心力—通常用离心力与重力的比值表示离心机的 离心能力，也称分离因素，用符号×g或g表示。
第六章 离子交换法 离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之 间结合力的差异进行物质分离的操作方法。带电粒子 与离子交换剂间的作用力是静电力。它们结合是可逆 的，在一定条件下能够结合，条件改变后也能被释放 出来。离子交换剂由惰性的不溶性载体，功能基团和 平衡离子组成。
Y＋ Z＋ X＋ X＋ Y＋ Y＋
大分子
小分子 C
V
GPC测分子量Βιβλιοθήκη Baidu
Y=A+BX
A
B C Vi
V0
第八章 亲和层析 利用生物大分子特异性亲和力而设计的层析技术称为亲核层析。 在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基（Ligand）， 与配基结合的层析介质称为载体（Matrix） 亲和层析的设计原理和过程： 1)配基固定化 选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成具 有特异性亲和性分离介质。 2)吸附样品 亲和层析介质选择性吸附酶或其它生物活性物质，杂质与层 析间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除。 3)样品洗脱 选择适宜的条件使被吸附的亲和介质上的酶或其它生物活性 物质洗脱。
6)氧化铝 活性氧化铝是最常用的一种吸附剂，特别适于亲脂性成 分的分离，广泛地用于在醇，酚，生物碱，染料，甾 体化合物，苷类，氨基酸，蛋白质以及维生素等物质 的分离。 7)硅胶 最常用 8)滑石粉 惰性 助滤剂 9)硅藻土 惰性 助滤剂 10)皂土 11)聚酰胺粉 12)大孔网格聚合物吸附树脂 极性，弱极性，非极性大孔吸附树脂 强酸性，弱酸性，强碱性，弱碱性等
4 N rm RCF 3600
2 2
mg
第十章 膜分离技术
分离范围
一般过滤 微孔过滤 >1μm 0.01~ 1μ m
分离动力
压力差 压力差
透析
超级过滤 反渗透 电渗析
5~100Å
5~100Å <5Å
<5Å
分子扩散
压力差 压力差 电能
第十一章 制备型高效液相色谱 制备型HPLC技术是利用大直径柱，分离制备大量纯物质 （>0.1g） HPLC的分离依据是样品中各组分之间带电性，极性，疏 水性，分子大小，等电点，亲和性，螯合性等理化性 质的差异。将样品导入柱头，流动相在高压泵的作用 下，其流量被准确地控制通过色谱柱，样品中各组分 在色谱柱中形成查速迁移，按时间先后流出层析柱， 然后进行检测和分部收集。 检测器 色谱数据处理
泵
色谱柱
溶剂
按固定相对样品的保留机理，HPLC大致可分为液固色谱， 键合相色谱，离子交换色谱，离子对色谱，凝胶色谱， 疏水色谱，亲和色谱，聚焦色谱，金属螯合亲和色谱 等。 色谱重要参数：分离度，分离速度，回收率，样品容量。 分离度Rs 理论塔板数N 容量因子K’—为溶质在固定相中得总摩尔数与流动相中 得总摩尔数之比。 选择因子α
生物制药工艺学第四章到第十一章
第四章 固相析出分离法 改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术 称为固相析出分离法。析出物为晶体时称为结晶；析出物 为无定形固体称为沉淀法。固相析出法主要有盐析法，有 机溶剂沉淀法，等电点沉淀法，结晶法等。 盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通 过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以 沉淀析出，达到纯化目的的方法。 盐析的机制：高浓度的中性盐溶液中存在着大量的带电荷的 盐离子，它们能够中和生物分子表面的电荷，使之赖以稳 定的双电层受损，从而破坏分子外围的水化层；另外，大 量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，从另一方 面摧毁了水化层，使生物分子相互聚集而沉淀。
第五章 吸附法 吸附是物质分子在两相界面上浓度的增加。 由于界面上的分子同时受到不相等的两相分子的 作用力，因此界面分子的力场是不饱和的，即 存在一种固体的表面力，它能从外界吸附分子、 原子或离子，并在吸附剂表面附近形成多分子 层或单分子层。我们称物质从流动性（气或液 相）浓缩到固体表面从而达到分离的过程称为 吸附作用。把在表面上能发生吸附作用的固体 称为吸附剂；将被吸附的物质称为吸附物。
预处理
上样
吸附
洗杂
洗脱
再生
常用吸附剂： 1)活性炭是一种吸附能力很强的非极性吸附剂，其吸附作 用在水溶液中最强，在有机溶剂中较弱，吸附能力的 顺序：水>乙醇>甲醇>乙酸乙酯>丙酮>氯仿。 2)人造沸石 人造沸石是一种人工合成的无机阳离子交换剂。用于细 胞色素C的分离。 3)磷酸钙凝胶 在蛋白质的分离、精制中，较为常用的吸附剂为磷酸钙 凝胶。（羟基磷灰石）活性部位为钙离子。 4)白陶土 5)氢氧化铝凝胶 用于蛋白质及酶的分离。
结晶法 改变溶液的某些条件，使其中的溶质以结晶态析出的过 程称作结晶。 （一）盐析结晶法 这是生化制药中应用最多的结晶方法。其作用是通过向 结晶溶液中引入中性盐，逐渐降低溶质的溶解度使其 过饱和，经过一定时间后晶体形成并逐渐长大。 （二）透析结晶 （三）有机溶剂结晶 （四）等电点结晶 （五）温度诱导结晶
有机溶剂沉淀法 向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶 解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。 主要机理：（1)亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电 常数，使得溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 (2)水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压 缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲 水性，导致脱水凝集。 等电点沉淀法 两性电解质，在溶液pH处于等电点（pI）时分子表面净电 荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏， 分子间引力增加，溶解度降低。调节溶解的pH值，使两性 溶质溶解度下降，析出沉淀的操作。
RS
t R 2 t R1 1 [(Wb )1 (Wb ) 2 ] 2
tR 2 N 5.54 ( ) 2 t 1
2
t0
t R t0 k' t0
k '1 k '2
tR1 tR2
X＋OH－ X＋
Ｘ＋
nX＋ X＋
X＋ X＋
X＋
Z＋
Z＋
X＋
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X＋
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Y＋
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Ｚ Ｚ＋
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平衡上样
吸附
洗杂
洗脱
第七章 凝胶层析 它是将样品化合物通过一定孔径的凝胶固定相，用于流 经体积的差异，使不同分子量的组成得以分离的层析。
L 配基 ＋ L
＋
S 样品 L
L
S
配基固定化 L ＋ S L S ＋ 杂质
吸附样品 L S L ＋ S
样品洗脱
第九章 离心技术
沉降作用—悬浮液静置时，在重力作用下，密度大于周 围溶液的固体颗粒逐渐下沉，成为沉降作用。 离心技术—在离心力场作用下，加速悬浮液中固体颗粒 沉降速度的方法称为离心技术。 相对离心力—通常用离心力与重力的比值表示离心机的 离心能力，也称分离因素，用符号×g或g表示。
第六章 离子交换法 离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之 间结合力的差异进行物质分离的操作方法。带电粒子 与离子交换剂间的作用力是静电力。它们结合是可逆 的，在一定条件下能够结合，条件改变后也能被释放 出来。离子交换剂由惰性的不溶性载体，功能基团和 平衡离子组成。
Y＋ Z＋ X＋ X＋ Y＋ Y＋
大分子
小分子 C
V
GPC测分子量Βιβλιοθήκη Baidu
Y=A+BX
A
B C Vi
V0
第八章 亲和层析 利用生物大分子特异性亲和力而设计的层析技术称为亲核层析。 在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基（Ligand）， 与配基结合的层析介质称为载体（Matrix） 亲和层析的设计原理和过程： 1)配基固定化 选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成具 有特异性亲和性分离介质。 2)吸附样品 亲和层析介质选择性吸附酶或其它生物活性物质，杂质与层 析间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除。 3)样品洗脱 选择适宜的条件使被吸附的亲和介质上的酶或其它生物活性 物质洗脱。
6)氧化铝 活性氧化铝是最常用的一种吸附剂，特别适于亲脂性成 分的分离，广泛地用于在醇，酚，生物碱，染料，甾 体化合物，苷类，氨基酸，蛋白质以及维生素等物质 的分离。 7)硅胶 最常用 8)滑石粉 惰性 助滤剂 9)硅藻土 惰性 助滤剂 10)皂土 11)聚酰胺粉 12)大孔网格聚合物吸附树脂 极性，弱极性，非极性大孔吸附树脂 强酸性，弱酸性，强碱性，弱碱性等
4 N rm RCF 3600
2 2
mg
第十章 膜分离技术
分离范围
一般过滤 微孔过滤 >1μm 0.01~ 1μ m
分离动力
压力差 压力差
透析
超级过滤 反渗透 电渗析
5~100Å
5~100Å <5Å
<5Å
分子扩散
压力差 压力差 电能
第十一章 制备型高效液相色谱 制备型HPLC技术是利用大直径柱，分离制备大量纯物质 （>0.1g） HPLC的分离依据是样品中各组分之间带电性，极性，疏 水性，分子大小，等电点，亲和性，螯合性等理化性 质的差异。将样品导入柱头，流动相在高压泵的作用 下，其流量被准确地控制通过色谱柱，样品中各组分 在色谱柱中形成查速迁移，按时间先后流出层析柱， 然后进行检测和分部收集。 检测器 色谱数据处理
泵
色谱柱
溶剂
按固定相对样品的保留机理，HPLC大致可分为液固色谱， 键合相色谱，离子交换色谱，离子对色谱，凝胶色谱， 疏水色谱，亲和色谱，聚焦色谱，金属螯合亲和色谱 等。 色谱重要参数：分离度，分离速度，回收率，样品容量。 分离度Rs 理论塔板数N 容量因子K’—为溶质在固定相中得总摩尔数与流动相中 得总摩尔数之比。 选择因子α