地高辛标记与检测DNA试剂盒说明书

地高辛标记与检测

D N A试剂盒说明书

集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-

地高辛标记与检测D N A试剂盒DIGDNALabelingandDetectionKit

采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP酶联免疫，随时即用。

此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应，

可检测10×10cm2面积的杂交膜50张

指导手册

1前言

1.1内容表

1前言

1.1内容表

1.2试剂盒成分

2.介绍

2.1产品简介

3.操作步骤和所需材料

3.1在你开始前

3.2流程图

3.3地高辛标记DNA

3.4标记效率的确定

3.5DNA的转移和固定

3.6杂交

3.7免疫检测

3.8DNA印记的洗脱和再杂交1.2试剂盒的成分

附加仪器与所需试剂

除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。

在每个操作程序的前面提供了详细的信息。

*标记的产品可以从RocheAppliedScience获得。

2.介绍

2.1产品概况

实验原则

此试剂盒采用DIG(地高辛)，一种甾类半抗原，steroidhapten去标记DNA探针用于杂交和后续的免疫检测。

应用

地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交

样品材料

至少100bp的DNA片段

线性的质粒，cos质粒或者DNA

超螺旋的DNA

实验时间

检测数量

一个试剂盒足够用于:

25个标准的标记反应，每个反应的膜板DNA不超过3μg；

并可以检测50张10×10cm2的杂交膜。

质量控制

根据操作步骤中的说明对未标记的对照DNA【pBR328】进行标记，并按照下面的标准检测操作方法在点杂交中用0.1pg同源DNA点在膜上16h 后成色显影检测。

试剂盒的储存和稳定性

未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15℃到-25℃（保质期印在标签上）。在干冰中运输。

一旦开封，请根据下表选择适宜的储存条件。

灵敏度和特异性

采用southern杂交从1μg人胎盘DNA（经BglⅡ或EcoRⅠ酶切）中检测到单拷贝基因。

3．实验步骤和所需材料

3.1在你开始前

主要的操作要求

此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示：

3.2流程图

3.3地高辛标记DNA

介绍

随机引物标记的DNA带有地高辛-11-dUTP,这一标记采用的是地高辛高效引物试剂，这是一种含有随机六碳糖，dNTP混合物的5×浓度标记混合物，其中dNTP混合物包括碱性标记的地高辛-11-dUTP，标记级的Klenow酶和适合的反应缓冲液。

附加设备和所需试剂

水浴

冰水混合物

此表中列出了成分，储存条件和除了试剂盒成分外所需试剂的用途。

模板DNA：模板DNA所需特征：

标记从琼脂糖凝胶上分离的DNA

如果你想要完成基因组的southern 杂交，你应该利用琼脂糖凝胶电泳将插入载体的模板DNA 从载体上分离出来。

为了从凝胶中分离DNA,你可以用琼脂糖凝胶DNA 提取试剂盒(theAgaroseGelDNAExtractionKit)进行大小在400bp-5kbp 范围内DNA 片段的回收。这一试剂盒既可以用于标准琼脂糖凝胶也可用于低熔点琼脂糖凝胶。然后，不需要进一步纯化即可对DNA 片段进行高效的地高辛标记。然后标记好的探针应该用高效的PCR 产物纯化试剂盒

（

HighPurePCRProductPurificationKit ）进行纯化，以去除残留的琼脂糖颗粒。 步骤

此步骤用于标记10ng-3μgDNA。可以通过扩大所有成分和体积标记更大量的DNA （最高达10μg）。

标记反应的产量

表1：

此表向您展示了在适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。在标准反应中每个实验采用1μgDNA作为模板。1小时内，大约有15%的核苷酸参与到了0.8μg新合成的地高辛标记DNA中。20小时后消耗了大约38%的核苷酸。

使用DIG-High-Prime溶液，增加不同模板DNA的量进行反应，并检测反应1小时和反应20小时的差异。地高辛标记DNA的产量由放射线示踪器进行测定，并通过斑点杂交进行证实（10个独立标记实验的平均值）。

3.4标记效率的确定

介绍

地高辛标记DNA产量的确定对于获得最佳的，具有可重现性的杂交结果十分重要。在杂交混合物中探针浓度过高容易产生背景，而太低浓度则容易导致信号弱。

实验原则

检测标记探针质量的好方法是直接检测法。

所需附加溶液的制备

请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液无DNA酶和RNA酶系列产品中获得。

试剂盒工作溶液的制备

下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法：

稀释系列

根据合成核苷酸的预期产量开始下面的的系列稀释，标记的探针和地高辛标记的对照DNA（Vial4）应该稀释到1ng/μL。利用第3.3章中图表可以最好的估计出在你的探针中地高辛标记DNA的预期产量。产量取决于起始时的模板量和孵育时间。

注意：表1中给出的产量是采用高纯度的DNA模板在最佳条件下生产出的。

按照下表中的描述对你标记的探针和你的对照DNA进行一系列的梯度稀释。