微卫星筛选方法课件24页PPT文档

6 双链恢复 13 荧光PCR及基因分型
7 质粒连接 14 数据分析
（1）DNA抽提 - Sambrook et al. 1989；其它方法
（2）酶切连接 - Mse I + T4 Ligase
（3）AFLP特异扩增DNA片段 - 酶切连接液为模板 - Mes I – N 引物
Leabharlann Baidu
（4）探针杂交 - 5，端生物素修饰的重复碱基探针与扩增
产物杂交
（5）磁珠洗脱 - 磁珠特异性吸附杂交片段，洗脱除去未
杂交片段
（6） 双链恢复 - 磁珠富集得到的目的单链以Mes I - N为
引物特异扩增恢复为双链
（7） 质粒连接 - PMD18-T vector
（8） 转化克隆 - DH5-α感受态细胞 涂板，37℃培养 11-13h
（9）单克隆扩增培养 - 挑取白色饱满菌落液体培养基培养5h
（10）菌落PCR选择目标克隆 - 三引物法 扩增产物为双带
（11）测序 -目标克隆菌液测序
（12）引物设计及优化 - CID软件分析序列及设计引物 - 引物扩增条件优化
（13）荧光PCR及基因分型 - 荧光修饰引物特异扩增 - 基因分型
（14）数据分析 - Genescan 读取基因分型数据 - 位点多态性信息 - 位点是否偏离哈温平衡 - 位点是否连锁不平衡
基于引物扩增的方法
❖ 基因组片段化和片段大小选择 ❖ 把片段转入噬菌体中从而得到一个单链的
DNA库 ❖ 以这些ssDNA为模板，以重复碱基引物做
PCR扩增，得到筛选库
基于引物扩增的方法
❖ 缺点：操作繁杂，使用重复碱基引物扩增的 效率较低从而使得一些较稀少的位点被忽略， 并且这个方法在筛选三四碱基重复的位点时 会出现单克隆的多拷贝情况
❖ 动物体中以双核苷酸（CA/GT）n最为常见
❖ 广泛分布于各种真核生物基因组中，非常丰 富且分布比较均匀
❖ 数量多、特异的PCR扩增、稳定性好、在基 因组内分布均匀、多态性信息丰富、易于检 测
完美（perfect）重复型
不完全（imperfect）重复型
复合（compound）重复 型
所有的微卫星分离筛选实验都是
❖ 跳过对基因组片段化和大小的选择 ❖ 充分利用了基因组，以免稀有微卫星的丢失。
❖ 步骤较为简单，方便快速，优化效率高，实 验成本较低。
1 DNA抽提 8 转化克隆
2 酶切连接 9 单克隆扩增培养
3 AFLP特异扩 10 菌落PCR选择目标克
增
隆
4 探针杂交 11 测序
5 磁珠洗脱 12 引物设计及优化
沙里淘金的过程
传统筛选法
❖ 使用限制性内切酶或者声波处理使基因组片 段化
❖ 电泳切胶选择300-700bp的片段作为筛选库 ❖ 连接到质粒中转化入感受态细胞中 ❖ 与放射性的探针做Southern杂交，选择出阳
性克隆后进行测序、引物设计和引物最优化
传统筛选法
缺点：实验成本高、耗时长而无法大批量操作， 并且由于使用放射性元素而使得操作过程不 安全。
什么是微卫星（Microsatellite）？
❖ 短串联重复(short tandem repeat，STR) 简单序列重复(simple sequence repeat， SSR)
❖ 由1-5个核苷酸为重复单位串联组成的长达 几十个核苷酸的序列,重复数为10~20次
❖ 含有串联重复的核心序列 两侧较保守的侧翼序列
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选择性杂交法
❖ 对目标物种的基因组进行片段化和片段大小 选择
❖ 将片段接入质粒或者加上接头 ❖ 与一定的探针杂交，杂交后的片断可以选择
杂交筛选和磁珠吸附两种方法对杂交片段进 行富集
FLASCO法（Fast isolation by AFLP of Sequences COtaining repeats）