纸层析法分离氨基酸

纸层析法分离氨基酸

一，实验目的

1、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术(包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。

2、学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。

实验原理

1、纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。

2、溶质在滤纸上的移动速度用比移值Rf值表示：

3、Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

4、在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。

实验材料与试剂

二，实验试剂

1、氨基酸标准液(1mg/mL)

亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。

2、80%甲酸

3、0.1%茚三酮丙酮溶液

4、氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL)

5、正丁醇

三，实验器材

1、新华滤纸

2

3、电热鼓风干燥箱

4、吹风机

5、毛细管

6、针、线、尺。

7、钟罩(高约430mm,直径约290mm，具磨口塞)

四，实验操作

标准氨基酸纸上层析

单向上行层析

氨基酸Rf值的测定

A、滤纸：选用国产新华1号滤纸，6cm×7cm。在距滤纸2cm处划线，用铅笔在线上标上

四个点作为点样位子（留出缝线空间）。

B、点样：点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清。用毛细管吸取

氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用吹风机吹干，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，影响定量结果。

将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。

C、展层：将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内(注意滤纸不要碰皿壁)，当溶剂展层至距离纸

的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置

酸溶剂系统：正丁醇：80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，茚三酮2ml。温度25℃，时间1h。

D、显色：待展层基本结束后, 置65℃鼓风箱中10-20min，鼓风

E、Rf值的计算：用尺测量

显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，即得氨基酸的Rf值。

E 计算出3种氨基酸在酸系统中的Rf值，判断待测样组成。

保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。

注意：使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。

五，实验结果

结果分析：此次做的亮氨酸脱色，可能的原因是没有点滴好，前沿上升到滤纸中部后无明显变动，可能与实验的温度有关。

六，思考题

1、为什么在展层时有时用一种溶剂系统，而有时用两种溶剂系统?

答：在样品所含溶质较多或某些组分在单相纸层析中的Rf比较接近,不易明显分离时,可采用双向纸层析法.即,如果只用一种展层溶剂系统不能把Rf值相近的氨基酸分离开时.该法是将滤纸在第一种溶剂系统中按一个方向展层以后,即予以干燥,再转向90度,在另一溶剂系统中进行展层,待溶剂到达所要求的距离后,取出滤纸,干燥显色,从而获得双向层析谱.应用这种方法,如果溶质在第一溶剂中不能完全分开,而经过第二种溶剂的层析能得以完全分开,大大的提高了分离效果.

2、酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对氨基酸极性基团的解离有何影响?

答：酸性溶液中，有利于氨基酸的碱式电离，氨基结合质子，整个分子带正电荷；反之，碱性溶液中有利于羧基的酸式电离，氨基酸分子整体带负电荷

3、酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对碱性氨基酸(赖、精、组)和酸性氨基酸(天冬、谷)的Rf

值有什么影响?

答：PH值影响，氨基酸的解离度与PH 有关，解离度越大极性越强，极性强的物质在两相分配时，偏向极性的一项。氨基酸解离度越大，Rf越小。（PH值对中性氨基酸的影响不大）往溶剂系统中对于加入碱，对于酸性氨基酸来说，羧基会更多的解离，自然Rf 降低（这个效果会很明显）。而对于碱性氨基酸的盐溶液来说，解离度降低，Rf增大（这个效果不会太明显，因为大部分都是以离子形式存在，解离度变化不大）。往溶剂加酸，对于酸性氨基酸来说，羧基变化不大，氨基接受质子更多解离，Rf降低。对于碱性氨基酸，解离度增大，Rf也减小

4、什么是分配系数？

答：定义1：在平衡状态下，组分在固定液与流动相中的浓度之比。

定义2：物质在两种不相混的溶剂中平衡时的浓度比。不同的物质在同一对溶剂中的分配系数不同，可利用该原理对物质分离纯化。

定义3：某种溶质在水和油中的溶解性的比例。用于测量某一生物分子的相对极性。