实验三、简单染色法

实验三 细菌的简单染色
目的要求
1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，掌 学习微生物涂片、染色的基本技术， 握细菌的简单染色法。 握细菌的简单染色法。 2. 初步认识细菌的形态特征。 初步认识细菌的形态特征。 3. 学习显微镜（油镜）的使用方法，熟悉 学习显微镜（油镜）的使用方法， 无菌操作技术。 无菌操作技术。
注意：水洗时，不要直接冲洗涂面， 注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应 使水从载玻片的一端流下。 使水从载玻片的一端流下。水流不宜过 过大，以免涂片薄膜脱落。 急，过大，以免涂片薄膜脱落。
6、干燥 、
自然干燥：平放于室温，自然干燥； 自然干燥：平放于室温，自然干燥；
吹干：用电吹风冷风或低温热风吹干； 吹干：用电吹风冷风或低温热风吹干；
下一个实验： 下一个实验：革兰氏染色法
1、涂片 、
1. 取一块干净的载玻片，平放， 在载玻片中央 取一块干净的载玻片 ， 平放， 滴一小滴生理盐水； 滴一小滴生理盐水； 2. 用接种环 无菌操作 从琼脂斜面上挑取适量菌 用接种环无菌操作 无菌操作从琼脂斜面上挑取适量菌 苔； 3. 将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混 匀并涂成薄膜。 匀并涂成薄膜。
一些物质的折射率： 一些物质的折射率： 水 玻璃 空气 香柏油
1.33 1.52 1.0 1.515
2、增加显微镜的分辨率
分辨率（分辨力） 分辨率（分辨力）是指显微镜能辨别物体两 点间最小距离的能力。 点间最小距离的能力。 λ
式中 λ=光波波长 光波波长
能辨别两点间最小距离 = 2N ⋅ A
数值孔径， 数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度 称镜口角)的一半正弦， (称镜口角)的一半正弦，乘上玻片与物镜间 介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示： 介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示： 其中
材
料
1. 菌种 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 2. 染色剂 3. 仪器或其他用具： 仪器或其他用具：
显微镜 酒精灯 载玻片 接种环 香柏油 二甲苯 擦镜纸 生理盐水等。 生理盐水等。
简单染色方法
涂片 干燥 固定
干燥 镜检 水洗 染色
作业
• 实验报告
结果部分： （结果部分：绘图说明金黄色葡萄球菌和枯草芽 孢杆菌的形态特征， 孢杆菌的形态特征，注明观察时使用的物镜及 放大倍数） 放大倍数）
• 简单染色：利用单一染料对菌体进行染色。 简单染色：利用单一染料对菌体进行染色。
发色基团和 • 染料是一类苯环上带有发色基团和助色基 染料是一类苯环上带有发色基团 的有机化合物。前者赋予染料颜色特征， 团的有机化合物。前者赋予染料颜色特征， 后者使染料能形成盐。 后者使染料能形成盐。 • 常用的微生物细胞染料都是盐，分酸性染 常用的微生物细胞染料都是盐， 料和碱性染料两大类：美蓝（即亚甲蓝）、 料和碱性染料两大类：美蓝（即亚甲蓝）、 结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、 ）、孔 结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、孔 雀绿等都属于碱性染料；酸性复红、 雀绿等都属于碱性染料；酸性复红、伊红 及刚果红属于酸性染料。 及刚果红属于酸性染料。
高倍镜观察
将高倍物镜转至镜筒下方 (在转换物镜时，要 在转换物镜时， 从侧面注视， 从侧面注视，以防低倍镜未对好焦距而造成镜 头与玻片相撞) 头与玻片相撞) 。
调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细 调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中， 转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象， 转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，移 动推动器选择最满意的镜检部位，待油镜观察。 动推动器选择最满意的镜检部位，待油镜观察。 物镜的同焦现象（ 物镜的同焦现象（P44） ）
2、显微观察
观察程序如下： 观察程序如下：
放置观察标本 低倍镜观察 高倍镜观察 油镜观察
放置观察标本
将标本玻片置于载物台上(注意标本朝上) 将标本玻片置于载物台上(注意标本朝上)， 用标本夹夹住， 用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处 于物镜的正下方。 于物镜的正下方。
低倍镜观察
下降低倍物镜，从侧面注视调节，使其接近标 下降低倍物镜，从侧面注视调节， 本。 双眼看目镜， 双眼看目镜，慢慢旋转粗调节螺旋使镜筒缓慢 升起，至视野内出现物象后，改用细调节螺旋， 升起，至视野内出现物象后，改用细调节螺旋， 上下微微转动，直至视野内获得清晰的物象。 上下微微转动，直至视野内获得清晰的物象。 慢慢移动玻片夹推动器，寻找要观察的部位， 慢慢移动玻片夹推动器，寻找要观察的部位， 置于视野中心，观察、记录结果， 置于视野中心，观察、记录结果，并准备换高 倍镜观察。 倍镜观察。
注意：载玻片要洁净无油迹； 注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌 不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。 不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。
2、干燥 、
将涂好菌膜的载玻片平放在室温下自然 干燥。也可用电吹风低温吹干。 干燥。也可用电吹风低温吹干。
3、固定 、
手持(木夹夹住)已干燥的涂有菌膜的载玻片， 手持(木夹夹住)已干燥的涂有菌膜的载玻片， 涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2 3 涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次。
油镜的工作原理（P42）
1、增加照明亮度
2、增加显微镜的分辨率
1、增加照明亮度
使用油镜时， 使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片 与接物镜之间，不是隔一层空气， 与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层 油质，称为油浸系。 油质，称为油浸系。 如果玻片与物镜之间的介质为空气， 如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干 燥系。 燥系。
使用完毕后的处理
观察完毕，上升镜筒，取下标本片。 观察完毕，上升镜筒，取下标本片。 先用擦镜纸擦去镜头上的油， 先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾 少量二甲苯擦去镜头上残留油迹， 少量二甲苯擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜 纸擦去残留的二甲苯。 纸擦去残留的二甲苯。 用绸布擦净显微镜的金属部件。 用绸布擦净显微镜的金属部件。 将各部分还原，关闭电源, 将接物镜转成八字形， 将各部分还原，关闭电源, 将接物镜转成八字形， 再向下旋。罩上镜套，然后放回镜箱中。 再向下旋。罩上镜套，然后放回镜箱中。 填写显微镜使用记录。 填写显微镜使用记录。
油镜观察
用粗调螺旋将镜筒上升， 用粗调螺旋将镜筒上升，转动转换器将油镜转至 镜筒正下方。 镜筒正下方。 在标本镜检部位滴上一滴香柏油。 在标本镜检部位滴上一滴香柏油。 从侧面注视，慢慢转动粗调螺旋，小心下降镜筒， 从侧面注视，慢慢转动粗调螺旋，小心下降镜筒， 使油镜浸入油中，并几乎与标本接触时为止( 使油镜浸入油中，并几乎与标本接触时为止(注意 切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头) 切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头)。 调节聚光器及照明后，眼看目镜， 调节聚光器及照明后，眼看目镜，微微转动粗调 螺旋将镜筒上升，当视野中有模糊的标本物象时， 螺旋将镜筒上升，当视野中有模糊的标本物象时， 改用细调螺旋， 改用细调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为 止。
N ⋅ A = n ⋅ sin
α
2
n = 介质折射率 α = 最大入射角，即镜口角
香柏油的折射率大于空气和水，因此， 香柏油的折射率大于空气和水，因此，它作介质 数值孔径值高于低倍镜和高倍镜。 时，数值孔径值高于低倍镜和高倍镜。
数值孔径值越大，显微镜最小可分辨距离越小， 数值孔径值越大，显微镜最小可分辨距离越小， 即分辨率越高。 即分辨率越高。
原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固，从而固定 原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固， 细菌细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。 细菌细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。 注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破 注意：热固定温度不宜过高， 坏细胞形态。 坏细胞形态。
4、染色 、
将热固定的细菌涂片平放于在载玻片架 热固定的细菌涂片平放于在载玻片架 上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖 滴加染液于涂片上（ 涂片薄膜为宜）。 涂片薄膜为宜）。 染色时间： 染色时间：
吕氏碱性美蓝染色1~2min； ； 吕氏碱性美蓝染色 石炭酸复红染色约1min 石炭酸复红染色约 草酸铵结晶紫染色约1min。 草酸铵结晶紫染色约 。
5、水洗 、
将细菌涂片上染液倒入废液缸中； 细菌涂片上染液倒入废液缸中； 涂片上染液倒入废液缸中 手持细菌染色涂片，置于废液缸上方， 细菌染色涂片 手持细菌染色涂片，置于废液缸上方， 用洗瓶中自来水冲洗涂片， 用洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的 水无色为止。 水无色为止。
微生物染色原理
在中性、碱性或弱酸性溶液中， 在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞 通常带负电荷；碱性染料在电离时， 通常带负电荷；碱性染料在电离时，其分 子的染色部分带正电荷， 子的染色部分带正电荷，易与细胞结合使 其着色。 其着色。
细胞处于酸性条件下（ 细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产 ），所带正电荷增加 所带正电荷增加， 酸），所带正电荷增加使用操作步骤
1、观察前的准备 观察前的准备 2、显微镜观察 3、显微镜使用完毕后的处理 、
1、观察前的准备
仔细阅读显微镜使用说明书 取镜（一手握镜臂，一手托底座） 取镜（一手握镜臂，一手托底座） 显微镜的放置（平放，距边缘约10cm 10cm） 显微镜的放置（平放，距边缘约10cm） 熟悉显微镜， 熟悉显微镜，检查显微镜 调节光源（光线均匀，亮度适宜） 调节光源（光线均匀，亮度适宜） 调节双筒显微镜的目镜 调节聚光器数值孔径 检查显微镜物镜、目镜、 检查显微镜物镜、目镜、聚光器
吸干：平放在一张吸水纸上， 吸干：平放在一张吸水纸上，上面覆盖 一张吸水纸，将细菌涂片两面水分吸干。 一张吸水纸，将细菌涂片两面水分吸干。
7、镜检 、
• 涂片干后镜检。 涂片干后镜检。 • 防止水的折射，以便于观察。 防止水的折射，以便于观察。
显微镜的基本结构（P41）
1. 物镜转换器 2. 物镜 3.标本夹 标本夹 4.载物台 载物台 5.聚光器 聚光器 6. 彩虹光圈 7.光源 光源 8. 镜座 9. 电源开关 10. 光源滑动变阻器 11. 粗调螺旋（粗调节器） 粗调螺旋（粗调节器） 12. 微调螺旋（细调节器） 微调螺旋（细调节器） 13. 镜臂 14.镜筒 镜筒 15.目镜 目镜 16.玻片夹推进器 玻片夹推进器