刺激隐核虫幼虫诱导斜带石斑鱼的体液免疫应答
斜带石斑鱼TLR3基因的克隆及其在刺激隐核虫感染时的表达分析
斜带石斑鱼TLR3基因的克隆及其在刺激隐核虫感染时的表达分析乔玮;李言伟;李安兴【期刊名称】《水生生物学报》【年(卷),期】2012(036)003【摘要】TLR3(Toll like receptor 3)是Toll 样受体家族的重要成员,通过识别病原相关分子模式,诱导宿主天然免疫应答.研究从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)中克隆得到TLR3 cDNA 序列,全长为2937 bp,包括107bp 的5′非编码区、100 bp 的3′非编码区和编码909 个氨基酸的2730 bp 的开放阅读框.TLR3 全长氨基酸序列包含1 个信号肽、18 个富含亮氨酸的重复序列(Leucine-rich Repeat LRR)、1 个跨膜结构域和1 个胞内TIR结构域(IL-R1 homologous region).同源比对显示,斜带石斑鱼TLR3 与其他已报道硬骨鱼类的TLR3 具有较高的同源性(52%-67%).组织表达分析显示,TLR3 在健康斜带石斑鱼的组织中具有较广的表达分布,其中在前脑、体肾和脾脏中表达量较高.刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)感染斜带石斑鱼后:在皮肤中TLR3的表达量呈现先降低后升高的趋势,从感染后第7 天开始上调,并在第10 天达到高峰;而在脾脏中,TLR3的表达量在感染6h 时就显著上调并达到峰值.结果表明斜带石斑鱼TLR3 在抗刺激隐核虫的免疫应答过程中可能发挥重要作用.%Toll-like receptor (TLR), one family of I type trans-membrane protein, is a kind of well-studied pattern recognition receptors (PRRs) recognizing pathogen-association molecular patterns (PAMPs). Mammalian TLR3 is best-known for its recognition of pathogen dsRNAand triggering various innate immune responses against virus infection. Incontrast to mammalian TLR3, piscine TLR3 can detect not only virus but also bacterial PAMPs. However, whether piscine TLR3 also involved in host anti-parasite immunity is still poorly understood. In the present study, we first cloned an Epinephelus coioides TLR3 (EcTLR3) cDNA sequence by homology cloning and RACE technique. The full length of EcTLR3 was 2937 bp including a 5'-terminal untranslated region (UTR) of 107 bp, a 3'-terminal untranslated region (UTR) of 100 bp and an open reading frame (ORF) of 2730 bp encoding a polypeptide of 909 amino acid residues. The putative isoelectric point (pi) and molecular weight (Mw) of EcTLR3 was 8.27 and 102.68 kD, respectively. The TLR family motifs, such as leucine-rich repeat (LRR) domains and Toll/ interleukin-1 receptor (TIR) domain were also conserved in EcTLR3, with 18 LRR domains and one TIR domain which were connected by one trans-membrane domain. The multiple sequence alignment demonstrated that the full length EcTLR3 amino acid sequence shared high percentage of identities with other teleost (52%—67%), and a somewhat higher sequence identity with the TIR domains (from 55% to 72%), showing that the TIR domain was more highly conserved than that of other domains during TLR3 evolution. To better understand the evolutionary relationship of EcTLR3, a phylogenetic tree was constructed using reported TLR3 protein sequence. The tree indicated that EcTLR3 was branched into the same cluster as that of other teleost TLR3, and showed a highly correlated evolutionary relationship with pufferfish TLR3. To determine the tissues expression pattern of EcTLR3, we examined EcTLR3 expression in healthy grouper by semi-quantitative RT-PCR. The results showed that the EcTLR3 was broadly expressed in all tested tissues, while the expression levels differed noticeably among the tissues, with strong expression in the spleen, trunk kidney and prosencephalon, which imply that EcTLR3 may play an important role in host innate immune response. To identify whether EcTLR3 involved in host anti- Cryptocaryon irritans immune responses, we detected the expression change of EcTLR3 in the skin and spleen at different time points (6h, Id, 2d, 3d, 5d, 7d, lOd and 14d) post parasite infection by real-time quantitative PCR. The result showed that in the skin, the expression level of EcTLR3 was significantly down-regulated at the early time points (from day 1 to 5), while was up-regulated from day 7 and reached the peak at day 10 post the primary infection. However, in the spleen, the expression level of EcTLR3 was immediately up-regulated and reached the peak at 6h post the parasite infection. The significant up-regulation of TLR3 expression was also observed at day 3 and 5 in the spleen post the primary infection. This result suggested that EcTLR3 may also play an important role in the host defense against C.irritans infection.【总页数】8页(P385-392)【作者】乔玮;李言伟;李安兴【作者单位】中山大学生命科学学院,水产品安全教育部重点实验室/生物防治国家重点实验室,广州,520275;中山大学生命科学学院,水产品安全教育部重点实验室/生物防治国家重点实验室,广州,520275;中山大学生命科学学院,水产品安全教育部重点实验室/生物防治国家重点实验室,广州,520275【正文语种】中文【中图分类】Q781【相关文献】1.刺激隐核虫感染诱导斜带石斑鱼MHC Ⅰα和β2m基因的表达谱分析 [J], 徐冬冬;徐舜;吴凤依;罗晓春2.刺激隐核虫感染诱导斜带石斑鱼MHCIα和β2m基因的表达谱分析 [J], 徐冬冬;徐舜;吴凤依;罗晓春;3.斜带石斑鱼Frizzled 4基因的克隆及表达分析 [J], 陈华谱;洪广;邓思平;朱春华;李广丽;陈燕;黄海;李水生4.斜带石斑鱼L-氨基酸氧化酶基因克隆及表达分析 [J], 杜贾贾; 江飚; 唐嘉嘉; 李安兴5.斜带石斑鱼ERP44基因的克隆与表达分析 [J], 徐泳娴;邹子鸿;汤菊芬;鲁义善;简纪常;蔡佳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
刺激隐核虫抑动抗原生物学信息及抗原特性分析
刺激隐核虫抑动抗原生物学信息及抗原特性分析柯翎;池洪树;龚晖【摘要】对刺激隐核虫抑动抗原基因进行生物学信息分析,利用抗原表位多肽制备了鼠源抗抑动抗原抗体,并研究其抗原特性.试验结果表明:利用表位串联多肽所制备的鼠源抗抑动抗原抗体包含有针对刺激隐核虫抑动抗原的特异性抗体,为刺激隐核虫单克隆抗体和疫苗的制备奠定了基础.【期刊名称】《福建农业科技》【年(卷),期】2014(000)001【总页数】5页(P40-44)【关键词】刺激隐核虫;抑动抗原;抗体【作者】柯翎;池洪树;龚晖【作者单位】福建省农业科学院生物技术研究所 350003;福建省农业科学院生物技术研究所 350003;福建农林大学动物科学学院;福建省农业科学院生物技术研究所 350003【正文语种】中文刺激隐核虫属原生动物门、前口目、隐核虫科、隐核虫属，可侵染大黄鱼、石斑鱼、卵形鲳鲹、河鲀、鲆鲽鱼等大部分海水养殖鱼类，造成极大危害。
以福建省主要养殖品种大黄鱼为例，在刺激隐核虫病流行季节，大黄鱼的感染率接近100%，病死率可达80%以上，每年经济损失2 亿元以上［1］。
刺激隐核虫幼虫对鱼类血清和黏液有趋向性，可主动寻找宿主［2］，刺激隐核虫存在多种具免疫原性的表面抗原，抑动抗原是其中之一［3］。
研究表明，抑动抗原在刺激隐核虫的侵染过程中起着重要作用，感染耐过鱼血清和体表黏膜抗体可识别抑动抗原，通过抑动、凝集刺激隐核虫幼虫达到阻挡刺激隐核虫侵染的目的［4］。
刺激隐核虫抑动抗原的表位研究有助于刺激隐核虫抗体、侵染特性的研究，对找出防控方法具有重要意义。
由于刺激隐核虫抑动抗原的含量很低，同时由于基因编码的嗜好性［5］，难以通过普通方法大量获得刺激隐核虫的抑动抗原。
本研究通过对刺激隐核虫抑动抗原基因进行生物信息学分析，找出潜在的抗原表位，进而合成表位串联多肽，制备了鼠源抗抑动抗原抗体，并对其特性进行研究，以期为进一步研究刺激隐核虫广谱性疫苗和单克隆抗体制备奠定基础。
刺激隐核虫感染诱导斜带石斑鱼MHCIα和β2m基因的表达谱分析
南方农业学报Journal of Southern Agriculture 2016，47 (12 ): 2145-2150ISSN 2095-1191; CODEN NNXAAB http ： // DOI ： 10.3969/j ： issn.2095-1191.2016.12.2145刺激隐核虫感染诱导斜带石斑鱼M f/C J a和基因的表达谱分析徐冬冬，徐舜，吴凤依，罗晓春+(华南理工大.学生物科学与工程学院，广辦510006)摘要：【質的】检验石斑coi'oldes)M HCla和疾■是齊参.与诱导坑寄.；■歲免靡.应答，为揭示鱼 类免疫系f t启动抗刺激隐核虫(_C W toc野oa im'tam)感染的细胞免疫_座答分乎机制打下【方法】以实时焚光g 量PCR对刺激隐核虫感染斜带石斑鱼前后施C J a和/3痛因在感染局部位点.和免疫器官中的表这变化进行裣测a 【绪舉】MHC^和_基因在健康斜带石斑鱼的鐵织中均呈组成性表达，且_在外周血、腮、头肾和脾脏中的表达量 敏高B经刺激隐核虫感染勝》MHCI a和細義因麵带石斑鱼皮肤中的表达_显上调，均在感染雜5 d达峰值，其中 MHC基因德韋大_量为2.6倍、ftifl基因的最大表迭量为6J#;在腮中=奢璧_动钱变化,而在头肾中以显著下 调为'九在脾脏中，國在刺激隐核虫感SI■第5d显著上调表达、为对照组的2.0倍,:毫感染后第7 d其表达水 乎略微下调，为对照组齒U倍;民祕親表达于感染S12 h即升高至对照组的4.0倍,此后呈下调表达趋势，至感染后 第S d其表达水乎#次上调为对照组的3.4倍3【结论】在刺激隐核虫感梁过程中，斜带石斑鱼MHCIa和因的相遂巖在皮肤、鳃、头f和脾脏中均发生3"明儀变化.即鱼类MHCI类分多舊能参:与：？机体的细胞免疫，在抗寄生 虫感染的特异性免疫应答过程中发挥重要作用关键词：石斑鱼f刺激隐梭虫M H C Js碁因；基因；表达谱分析中图分类号：S965.334 文献标志码:A 文章编号:2095-；tl91(_2016)12-2145-06Expression pattern analysis on M H C I a and genes inEpinephelus coioides infected by Cryptocaryon irritansXU Dong-dong, XU Shun, WU Feng-yi, LUO Xiao-chun*(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of T echnology, Guangzhou 510006，China)AJbstrHCt:【ObjectivejTTie purpose of this study was to verify whether MHC i" a and )32切 genes in coioic/es were invovled in the induction of anti-parasite immune response and lay a foundation to reveal molecular mechanism of cellular imune response started of infected fish by Cryptocaryon irritans.【Method】Real-time quantitative PCR was applied to investigate expression levels of MHC I o l and p2tn genes before and after E. coioides infected by C. irritans in local infection sites and immune organs.【Result】MHC i" a and j32in genes were both constitutively expressed in healthy tissues ofE. coioides,with higher expressions in peripheral blood, gill, spleen and head kidney. After infected by C. irritans,significant up-regulations of MHC I〇i and genes were detected in skin and reached the peak on day 5 post infection. The maximum expression of MHC I o l gene was 2.6 times and j32/u gene 6.1 times. They were both fluctuated in gill and their significant declines were observed in head kidney at most time points. In spleen, the expression of MHC I a.gene was up-regulated on day 5 significantly after infected by C. irritans, which was as 2 times as that in CK; and slightly declined on day 7, which was as 1.5 times as that in CK. In terms of gene, the expression was un-regulated after 12 hours of infection and as high as 4.0 times of that in CK; later the expression was down-regulated until day 5, when the expression was up-regulated again to 3.4 times of that in C K.【Conclusion】During C*. irritans infection process，the relative expressions of MHC I〇i and p2m genes in E. coioides are both found to be significantly regulated in skin, gill, spleen and head kidney. These results indicate that fish MHC I molecule may be involved in cellular immune and play an important role in activation of specific cellular immune response to parasites.Key words：Epinephelus coioides；Cryptocaryon irritans;MHC I ol gene；gene；expression pattern analysis收稿日期:2016-03-08基金项目：國家商然科学義衾项_(3l3〇22〇8 >作者简介:*为通讯作者,罗晓春(1977-).:,.教授，.續从雜类寄生虫兔疫应答研究工作,E_mail卩elw®.咖研究方.向为寄生虫兔疫座答，E-jnail:676949517@qq.c.〇m•2146•南方农业学报47卷0引言【研究意义】斜带石斑查..(fipinepAe/us coioj.c/es).俗 称青斑、老虎斑，隶属于鮪科（Serranidae)石斑鱼属(Epinephelus)，是我国南方地区养殖的重襄名费海水 鱼类，但随着养殖规模的不断扩大及养殖环境的恶化 等，其寄生虫病害暴发日趋频繁。
斜带石斑鱼黏膜免疫系统结构的研究
斜带石斑鱼黏膜免疫系统结构的研究罗晓春;李安兴;谢明权【期刊名称】《水生生物学报》【年(卷),期】2005(029)002【摘要】对斜带石斑鱼皮肤、眼角膜、鳃、前肠及后肠等黏膜相关免疫组织结构进行了研究.通过组织切片的H-E染色及透射电镜的观察,描述了黏膜组织的显微结构、主要免疫相关细胞在黏膜组织中的分布情况及各免疫细胞的超微结构.结果表明黏膜组织中存在杯状细胞、淋巴细胞、巨嗜细胞、单核细胞、嗜曙红细胞、嗜中性粒细胞等免疫相关细胞,具有在黏膜局部独立完成免疫应答的细胞基础.另外,还观察到了皮肤表皮对异物的吞噬过程.本文还就黏膜免疫组织的非特异和特异性免疫应答,以及黏膜免疫是否独立于系统免疫等问题进行了讨论.【总页数】6页(P193-198)【作者】罗晓春;李安兴;谢明权【作者单位】中山大学生命科学学院,广州,510275;中山大学生命科学学院,广州,510275;中山大学生命科学学院,广州,510275【正文语种】中文【中图分类】S965.334【相关文献】1.闽南地区斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）神经坏死病毒的基因型与分子进化研究 [J], 朱志煌;林克冰;周宸;吴建绍;葛辉;郑乐云;黄种持;2.黏膜免疫系统及黏膜免疫佐剂的研究进展 [J], 白雪飞;郭静玉;雷万军;段广才3.神经坏死病毒疫苗免疫后3种免疫相关基因在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)组织中的表达研究 [J], 朱志煌; 林建伟4.神经坏死病毒疫苗免疫后3种免疫相关基因在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)组织中的表达研究 [J], 朱志煌; 林建伟5.海水鱼哈维氏弧菌、溶藻弧菌病二联灭活疫苗对斜带石斑鱼和卵形鲳鲹的注射、浸泡免疫研究 [J], 巩华; 陈丽玲; 赖迎迢; 石存斌; 孙承文; 陶家发因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
斜带石斑鱼T细胞免疫球蛋白黏蛋白-4(TIM-4)基因表达及重组蛋白制备
斜带石斑鱼T细胞免疫球蛋白黏蛋白-4(TIM-4)基因表达及重组蛋白制备李金泽;汤菊芬;黄瑜;简纪常;施钢;蔡佳【期刊名称】《大连海洋大学学报》【年(卷),期】2022(37)3【摘要】为研究斜带石斑鱼Epinephelus coioides T细胞免疫球蛋白黏蛋白-4(T-cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule 4,TIM-4)在免疫应答过程中的作用,通过聚合酶链式反应(PCR)获得斜带石斑鱼TIM-4的蛋白编码区(GenBank登录号:MZ465580),利用生物信息学分析其结构特征,采用荧光定量PCR(qPCR)分析TIM-4在健康鱼体中的组织分布,以及经LPS和Poly I:C 刺激后的表达变化,并构建原核表达载体质粒TIM-4-4T,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行TIM-4重组蛋白诱导表达。
结果表明:斜带石斑鱼TIM-4基因的蛋白编码区片段长度为702 bp,可编码234个氨基酸,含有V-Type(IGV)、BTK和PRY 3个功能结构域;qPCR显示,TIM-4基因在斜带石斑鱼10种组织中均有表达,在胃中的表达量最高(P<0.05),在脾脏中表达量最低;经LPS刺激后,脾脏细胞中的TIM-4表达量显著降低(P<0.05),而经Poly I:C刺激后,脾脏细胞中的TIM-4表达量显著升高(P<0.05);SDS-PAGE电泳显示,TIM-4重组蛋白相对分子质量约为25100,以包涵体形式表达,在0.4 mmol/L IPTG、37℃下诱导6 h时,TIM-4重组蛋白的表达量最大。
研究表明,TIM-4基因可能参与了斜带石斑鱼抗感染免疫反应,本研究结果为深入了解TIM-4的生物学功能提供了理论基础。
【总页数】8页(P403-410)【作者】李金泽;汤菊芬;黄瑜;简纪常;施钢;蔡佳【作者单位】广东海洋大学水产学院(湛江);广西科学院广西北部湾海洋研究中心【正文语种】中文【中图分类】S943【相关文献】1.尘螨变应性鼻炎与T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-3(Tim-3)启动子区-882T>C基因多态性的研究2.过敏性紫癜性肾炎患儿血清白细胞介素-33和T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-1的表达及临床意义3.IgA肾病大鼠肾组织中T细胞免疫球蛋白与黏蛋白域基因1的表达和意义4.斜带石斑鱼热休克蛋白基因HSP70在LPS和Poly I:C刺激下的表达分析及重组蛋白制备5.猪源T细胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白-1(TIM-1)多克隆抗体制备与鉴定因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
刺激隐核虫幼虫诱导斜带石斑鱼的体液免疫应答
刺激隐核虫的生活周期的四个阶段（见图示），我们采用的 是Colorni和Burgess(1997)的术语：滋养体(trophont)、胞 囊前体(protomont)、胞囊(tomont)和幼虫(theront)。
迄今为止，对刺激隐核虫生活史中各个阶段的免疫 应答研究尚未见报道。
本文就刺激隐核虫的幼虫阶段所引起的体液
抗血清 120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 时间（周） 10 12 14 皮肤培养液
阻动效价
致死剂量幼虫攻毒后各实验组鱼的死亡率
确定幼虫对卵形鲳鲹的致死剂量实验中，我们发现幼虫感染 剂量达到20×103个幼虫.鱼-1时就可以让全部的鱼死亡，因 此把致死剂量定为20×103个幼虫.鱼-1。经致死剂量幼虫感 染后各组实验鱼的死亡情况如表3所示。结果显示，对照组 的实验鱼在5 d之内全部死亡，而腹腔注射幼虫后最终死亡 率为60%，降低了40%。
毕业论文答辩
刺激隐核虫幼虫诱导的斜带石斑鱼体液免 疫应答
姓名：梁富 指导老师：但学名
目
实验目的
实验的材料与方法 实验的数据结果 实验讨论
录
一 . 实 验 目 的
刺激隐核虫是一种纤毛类寄生虫，对水产养殖和观 赏鱼类造成了极大危害，在短时间内就会引发严重 感染和高死亡率，对经济生产造成了很大的损失。 近几年来，关于鱼类对对刺激隐核虫的免疫应答引 起了研究者的重视，刺激隐核虫幼虫免疫的石斑鱼 血清和粘液中都发现了特异性抗体，并具有很好的 免疫保护性 在感染后治疗过程中，相对于化学治疗来说，免疫 接种的方法是一种更为安全和有效的措施。
免疫应答过程进行研究，以期能找到具有最 高免疫原性和免疫保护性的免疫原，为以后 疫苗的研制与开发奠定基础。
海南岛石斑鱼刺激隐核虫病发病规律调查
海南岛石斑鱼刺激隐核虫病发病规律调查王永波;王秀英;刘金叶;刘天密【摘要】采用定点采样检测和重点区域重点检测的方法,调查了2014-2015年间海南岛主要石斑鱼养殖区刺激隐核虫病的发病情况和流行规律.结果显示,石斑鱼刺激隐核虫病总体发病率稍微降低,其中,点带石斑鱼、斜带石斑鱼、豹纹鳃棘鲈最容易寄生暴发刺激隐核虫病;从石斑鱼养殖区发病地理位置分析,刺激隐核虫病主要集中在文昌到万宁等东部沿海地区;从流行季节分析,当水温低于25℃时文昌至万宁沿海每年的春夏、秋冬之交均会大量发病,在琼海欧村、万宁港北均出现大量暴发而导致整塘死亡的个案.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2016(043)005【总页数】5页(P152-156)【关键词】海南岛;刺激隐核虫病;石斑鱼;流行性【作者】王永波;王秀英;刘金叶;刘天密【作者单位】海南省海洋与渔业科学院,海南海口570203;海南省水产品质量安全检测中心,海南海口570200;海南省海洋与渔业科学院,海南海口570203;海南省水产品质量安全检测中心,海南海口570200【正文语种】中文【中图分类】S941.5;S965.334王永波，王秀英，刘金叶，等.海南岛石斑鱼刺激隐核虫病发病规律调查［J］.广东农业科学，2016，43（5）：152-156.目前，海南岛已发展成为我国最大的石斑鱼养殖和育苗生产基地，建有完善的石斑鱼亲鱼培育、人工育苗、标粗、养成、加工销售产业链。
据海南省海洋渔业厅和海南省南海鱼类苗种协会数据统计，2015年全省石斑鱼苗种年产量达2亿尾以上，其中石斑鱼苗种约70%销往广东、广西、福建和越南，苗种产量位居全国首位，养殖商品鱼产量达3万t以上，养殖的石斑鱼主要有珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）、点带石斑鱼（Epinephelus malabaricus）、斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）、棕点石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus）、鞍带石斑鱼（Epinephelus lanceolatus）、驼背鲈（Cromileptesaltivelis）和豹纹鳃棘鲈（Plectropomus leopardus）等7大品种，养殖方式主要有近岸网箱（渔排）养殖、池塘养殖和工厂化养殖［1］。
刺激隐核虫感染的免疫预防研究进展
刺激隐核虫感染的免疫预防研究进展作者：余玲莹，黄晓红来源：《福建农业科技》2021年第02期摘要：综述了刺激隐核虫感染诱发的免疫应答及其免疫预防的研究现状，为开发阻断或减少刺激隐核虫感染的方法提供参考。
研究显示，刺激隐核虫感染可以诱发宿主鱼的先天性和适应性免疫;利用刺激隐核虫的虫体（特别是幼虫）以及表面蛋白（或抑动抗原）的重组蛋白和真核表达的重组质粒DNA免疫宿主鱼，均获得了一定的相对免疫保护率（40%～100%）。
今后应进一步研究鱼与刺激隐核虫之间的相互作用，以便综合利用鱼对刺激隐核虫的免疫应答，研发高效、多元化的刺激隐核虫病的防治方法。
关键词：刺激隐核虫;刺激隐核虫病;免疫应答;免疫预防中图分类号：Q 95文献标志码：A文章编号：0253-2301（2021）02-0063-07DOI： 1013651/jcnkifjnykj202102012Research Progress on the Immunoprophylaxis of Cryptocaryon Irritans InfectionYU Lingying， HUANG Xiaohong*（College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China）Abstract： The research status of the immune response induced by the infection of Cryptocaryon irritans and its immunoprophylaxis were reviewed， in order to provide reference for the development of methods to block or reduce the infection of Cryptocaryon irritans. The research showed that the infection of Cryptocaryon irritans could induce the innate and adaptive immunity of the host fish. The relative immune protection rate （40%-100%） was obtained by immunizing the host fish with the insect bodies of Cryptocaryon irritans （especially larvae）， the recombinant proteins of surface proteins （or immobilization antigens） and the recombinant plasmid DNA expressed in eukaryons. In the future， it is necessary to further study the interaction between fish and Cryptocaryon irritans，so as to comprehensively utilize the immune response of fish to Cryptocaryon irritans， and develop the efficient and diversified prevention and control methods of cryptocaryoniosis.Key words： Cryptocaryon irritans; Cryptocaryoniosis; Immune response; Immunoprophylaxis刺激隱核虫Cryptocaryon irritans是寄生在海水硬骨鱼身上的一种纤毛虫类原生动物，其生活史包括4个阶段：幼虫期、滋养体期、包囊前体期、包囊期[1]。
斜带石斑鱼天然免疫受体TLR22基因及其真核表达载体与应用[发明专利]
![斜带石斑鱼天然免疫受体TLR22基因及其真核表达载体与应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/6ad33aed79563c1ec4da7155.png)
专利名称：斜带石斑鱼天然免疫受体TLR22基因及其真核表达载体与应用
专利类型：发明专利
发明人：卢丹琪,丁旭,何良格,梁瑶思,张勇,林浩然
申请号：CN201710557743.2
申请日：20170710
公开号：CN108118061A
公开日：
20180605
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明首次公开了一种斜带石斑鱼天然免疫受体基因及其真核表达载体与应用。
基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO：1所示，基因的全长cDNA序列如SEQ.ID.NO：2所示，其序列上包含的一对引物序列如SEQ.ID.NO：4～5所示，TLR22蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO：3所示。
本发明还提供一种含所述基因全长cDNA序列的真核表达载体pcDNA3.1‑EcTLR22。
此外，本发明将基因或TLR22蛋白应用于调节炎症因子表达、在参与识别病毒RNA及调节免疫因子表达、细胞免疫应答方面的研究中。
申请人：中山大学
地址：510275 广东省广州市海珠区新港西路135号
国籍：CN
代理机构：广州粤高专利商标代理有限公司
代理人：单香杰
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斜带石斑鱼IFN-γ基因的克隆与表达分析
中国水产科学 2013年3月, 20(2): 269−275 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2012−02−28; 修订日期: 2012−06−13.基金项目: 国家自然科学基金委与广东省联合基金资助项目(U0631010); 国家“863”计划项目(2012AA092201). 作者简介: 黄贝(1982-), 男, 博士, 研究方向为鱼类免疫学. Tel: 027-********.通信作者: 聂品, 研究员, 主要从事水产动物免疫和病害方面的研究. Tel: 027-********, E-mail: pinnie@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2013.00269斜带石斑鱼IFN-γ基因的克隆与表达分析黄贝1, 陈善楠1, 黄文树2, 聂品11. 中国科学院 水生生物研究所, 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 湖北 武汉430072;2. 集美大学 水产学院, 福建 厦门 361021摘要: IFN-γ在天然免疫和适应性免疫应答中均发挥着重要的作用。
由于低等脊椎动物IFN-γ与哺乳动物IFN-γ相似性非常低, 硬骨鱼类的IFN-γ近年来才得到鉴定。
本研究报道了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides )的IFN-γ基因, 并对其表达进行了分析。
斜带石斑鱼IFN-γ cDNA 全长为867 bp, 编码200个氨基酸。
其基因组全长为5 104 bp, 由4个外显子、3个内含子组成。
氨基酸序列比对显示斜带石斑鱼IFN-γ与高等脊椎动物IFN-γ的序列相似性较低, 仅为32.5%～39%, 与其他硬骨鱼类的IFN-γ相似性为38.0%～68.5%。
序列分析结果显示, 斜带石斑鱼IFN-γ分子C 末端中存在IFN-γ的特征序列以及核定位基序。
二级结构分析结果显示斜带石斑鱼IFN-γ序列中包含6个α螺旋结构, 其排列与高等脊椎动物的IFN-γ类似。
斜带石斑鱼TLR3基因的克隆及其在刺激隐核虫感染时的表达分析
最近的研究 发现河豚 Ｔ Ｒ Ｌ ３与哺乳 动物 Ｔ Ｒ Ｌ３
相 同也 能识 别 Ｐ ｌ Ｉ ）”。 ｏｙ（ ｃ ］ 另外 ，在鱼类 中由细 菌 ： 引起 的 Ｔ Ｒ ＮＡ水 平 的变 化也 有报 道 。 ｉ ｄ ａ ， Ｌ ３ｍＲ Ｂ ｌ ｅｕ ｏ Ｐ ， Ｐ ｅａ ，ｅ ａ． 日． ｈ ｌｎ ｔ １ 和 的研究 显示 ，革 兰氏 阴性 菌 能 诱 导斑 点叉 尾鲴和斑 马鱼 Ｔ Ｒ Ｌ ３的表 达 】 然 而在 ， 。 Ｒ ｄｉｕ ｚ ｅ ａ．和 Ｂ ｏ ｒｓｒ ｕ， ｌ １ ｏ ｒ ｅ． ｔ ｔ ｇ ａｐａｅｔ ｌｅ ａ． ｋ 的研究 中却
识 别 ｄＲ Ａ，并 通 过 不 依 赖 于 Ｍｙ ８ 的 信 号 途 ｓＮ Ｄ８ 径 诱 导 干扰 素及 干 扰素 相关 基 因的表 达 ， 与抗 病 参
毒过程 ［。另外 ， Ｌ ３还 可 以激 活 ＤＣ细胞 的成 熟 ， ４ 】 ＴＲ 调 节获 得性 免疫 ［ 。随着 研究 的深 入 ，鱼类 Ｔ Ｒ ３ ， Ｌ ３ 也成 为研究的重点 。 目前 ，已从斑 马鱼（ ｎｏ ｅｉ） Ｄａ ｉ ｒｒ ［ ｏ 、 河 豚 （ａ ｉ ｇ ｒｂ ｉｅ） Ｊ 斑 点 叉 尾 ￣ （ ｔｌｒｓ Ｔｋ ｕｕ ｕｒ ｓ 、 ｆ ｐ １ ａｕ ｕ ｃ ｐ ｎ ｔｔｓ［、 ｕ ｃａｕ） 虹鳟 （ ｃ ｒｙ ｃ ｕ ｙ ｉ ） 稀 有约鲫 引 Ｏｎｏ ｈ ｎｈ ｓ ｋ ｓ［ ｍ ｓ 、 （ ｏ ｉｃｐ． ａｕ） 刚 Ｇ ｂｏｙ ， ｒ ｒｓ［ 、鲫鱼 （ ａ ａｓ ｓ ｕａｕ） ” ｉ ｓ Ｃ ｒ ｓｉ ｒｔｓ［ 、 ｕａ
刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)的研究进程
刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)的研究进程[摘要] 本文介绍了刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)研究的历史和进展进程。
已知刺激隐核虫的生活史分三个阶段：寄生阶段的滋养体期、分裂繁殖阶段的包囊期、具感染能力的幼虫期。
介绍了刺激隐核虫的组织结构、感染机制等研究状况，并从化学、物理、免疫等方面探讨刺激隐核虫防治措施。
[关键词] 刺激隐核虫刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans Brown，1951）隶属纤毛虫纲膜口目、凹口科（Ophryoglenidae）[1]，一种寄生在海水硬骨鱼上的全毛类纤毛虫。
该虫是由日本学者Sikama[1]于1937年在日本爱知县东大农学部附属水产实验所的44种海水观赏鱼上首先发现的，并做了初步研究。
该虫寄生于海水硬骨鱼的腮、皮肤、眼、舌等部位，病灶部位会出现边缘明显的“白点”，俗称“白点病”，它引起的病症和淡水小瓜虫病引起的病症类似，又称其为“海水小瓜虫”。
而正式定名是由英国学者Brown于1951年将这种寄生虫定名为刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans，Brown，1951 ) [2]1.分类地位和地理分布分类地位：刺激隐核虫（Cryptocaryon irritansBrown），又称海水小瓜虫（Ichthyophthirius marinus），两者同物异名。
属原生动物门、纤毛亚门、寡膜纤毛纲、膜口亚纲、膜口目、凹口科、隐核虫属的一种。
地理分布[3]：刺激隐核虫病的相关报道多数发生在海水养殖系统和海洋水族馆中。
在中国、泰国、澳洲、日本等海域环境中，都能分离到刺激隐核虫。
刺激隐核虫一度被认为只存在于温暖的环境中。
但是Diamant et al.在1991年发现东地中海冷水海域有余刺激隐核虫对应的生物，Diggles and lester （1996）在水温能降到15℃的澳洲昆士兰的Moreton 湾也分离到了虫体。
大黄鱼在感染刺激隐核虫后MHC ⅡB基因的表达
大黄鱼在感染刺激隐核虫后MHC ⅡB基因的表达陈健;张东玲;叶坤;王志勇【摘要】[目的]为进一步研究大黄鱼抗刺激隐核虫的免疫防御奠定基础,也为海水鱼类养殖的免疫预防提供参考.[方法]用孵化2h内的刺激隐核虫感染大黄鱼,并运用Real-time PCR检测MHC ⅡB基因在各组织(鳃、皮肤、脾和头肾)中表达量的变化.[结果]MHCⅡB基因在鳃、皮肤和脾脏中的表达水平呈现先上调后逐渐下降的趋势,在感染6和12 h后表达量显著升高(P＜0.05);在头肾中,MHCⅡB基因在感染后6和12 h的表达量显著下调(P＜0.05),在感染2d后显著上升(P＜0.05).[结论]大黄鱼MHC ⅡB基因在刺激隐核虫的免疫应答过程中可能发挥重要作用.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)007【总页数】4页(P143-146)【关键词】大黄鱼;MHC ⅡB;刺激隐核虫【作者】陈健;张东玲;叶坤;王志勇【作者单位】集美大学水产学院,农业部东海海水健康养殖重点实验室,福建厦门361021;集美大学水产学院,农业部东海海水健康养殖重点实验室,福建厦门361021;集美大学水产学院,农业部东海海水健康养殖重点实验室,福建厦门361021;集美大学水产学院,农业部东海海水健康养殖重点实验室,福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】S965.322主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)是目前已知存在于所有脊椎动物体内与机体免疫机能密切相关的基因群[1-2]。
最常见的MHC 主要由2类分子组成：MHC I和MHC II类。
MHC I类分子负责将内源性抗原呈递给CD8+ T细胞，MHC II类分子则将外源性抗原呈递给CD4+细胞[3-4]。
MHC II类分子由α链和β链组成，其中MHC IIB基因编码β链区域，是研究最为广泛的一类MHC II分子[5-6]。
刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)的研究进程
刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)的研究进程[摘要] 本文介绍了刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)研究的历史和进展进程。
已知刺激隐核虫的生活史分三个阶段：寄生阶段的滋养体期、分裂繁殖阶段的包囊期、具感染能力的幼虫期。
介绍了刺激隐核虫的组织结构、感染机制等研究状况，并从化学、物理、免疫等方面探讨刺激隐核虫防治措施。
[关键词] 刺激隐核虫刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans Brown，1951）隶属纤毛虫纲膜口目、凹口科（Ophryoglenidae）[1]，一种寄生在海水硬骨鱼上的全毛类纤毛虫。
该虫是由日本学者Sikama[1]于1937年在日本爱知县东大农学部附属水产实验所的44种海水观赏鱼上首先发现的，并做了初步研究。
该虫寄生于海水硬骨鱼的腮、皮肤、眼、舌等部位，病灶部位会出现边缘明显的“白点”，俗称“白点病”，它引起的病症和淡水小瓜虫病引起的病症类似，又称其为“海水小瓜虫”。
而正式定名是由英国学者Brown于1951年将这种寄生虫定名为刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans，Brown，1951 ) [2]1.分类地位和地理分布分类地位：刺激隐核虫（Cryptocaryon irritansBrown），又称海水小瓜虫（Ichthyophthirius marinus），两者同物异名。
属原生动物门、纤毛亚门、寡膜纤毛纲、膜口亚纲、膜口目、凹口科、隐核虫属的一种。
地理分布[3]：刺激隐核虫病的相关报道多数发生在海水养殖系统和海洋水族馆中。
在中国、泰国、澳洲、日本等海域环境中，都能分离到刺激隐核虫。
刺激隐核虫一度被认为只存在于温暖的环境中。
但是Diamant et al.在1991年发现东地中海冷水海域有余刺激隐核虫对应的生物，Diggles and lester （1996）在水温能降到15℃的澳洲昆士兰的Moreton 湾也分离到了虫体。
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四.讨论与实验意义
本研究的结果显示，腹腔注射刺激隐核虫幼虫能使 斜带石斑鱼的血清和皮肤培养液产生阻动隐核虫幼 虫的特异性抗体，并能使免疫鱼获得很好的免疫保 护，这意味着刺激隐核虫的全虫疫苗可以成为防治 海水白点病的一个有效途径。
与腹腔注射刺激隐核虫滋养体和包囊相比较，幼虫 引发的系统免疫应答强度（即抗血清的阻动效价） 和皮肤粘膜免疫应答强度（即皮肤培养液的阻动效 价）都显著增高，这说明幼虫的免疫抗原性要比滋 养体和包囊强得多。 刺激隐核虫生活史的三个发育阶段中，只有幼虫期 具有较好的免疫原性，而其它两个阶段免疫原性较 差。可以将幼虫期作为首选来研制灭活疫苗，为防 御和治疗刺激隐核虫病奠定了基础。所以，从我们 的研究结果来看，刺激隐核虫病的预防和防治应该 从幼虫期为出发，进行灭活疫苗疫苗或者基因工程 疫苗的研究。
抗血清 120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 时间（周） 10 12 14 皮肤培养液
阻动效价
致死剂量幼虫攻毒后各实验组鱼的死亡率
确定幼虫对卵形鲳鲹的致死剂量实验中，我们发现幼虫感染 剂量达到20×103个幼虫.鱼-1时就可以让全部的鱼死亡，因 此把致死剂量定为20×103个幼虫.鱼-1。经致死剂量幼虫感 染后各组实验鱼的死亡情况如表3所示。结果显示，对照组 的实验鱼在5 d之内全部死亡，而腹腔注射幼虫后最终死亡 率为60%，降低了40%。
刺激隐核虫的生活周期的四个阶段（见图示），我们采用的 是Colorni和Burgess(1997)的术语：滋养体(trophont)、胞 囊前体(protomont)、胞囊(tomont)和幼虫(theront)。
迄今为止，对刺激隐核虫生活史中各个阶段的免疫 应答研究尚未见报道。
本文就刺激隐核虫的幼虫阶段所引起的体液
对照组 50 40 幼虫免疫组
阻动效价
30 20 10 0 1 2 3 4 5 时间（周） 6 7 8
抗血清和皮肤培养液阻动效价的变化差异
ห้องสมุดไป่ตู้
腹腔注射幼虫后，实验鱼的抗血清和皮肤培养液的阻动效价 存在明显的差异：两者的最初生成时间、达到峰值的时间、 变化规律等都不一致，并且在实验过程中，皮肤培养液的阻 动效价一直显著低于抗血清的阻动效价。
免疫应答过程进行研究，以期能找到具有最 高免疫原性和免疫保护性的免疫原，为以后 疫苗的研制与开发奠定基础。
二.实验材料与方法
实验鱼的来源、检测及驯养
→刺激隐核虫幼 虫的来源→ 实验分组→免疫方法→抗血清的 制备方法→皮肤培养液的制备方法→血清抗 体和皮肤培养液阻动效价的测定→幼虫对实 验鱼致死剂量的测定→ 攻毒→数据统计方法。
对照组 200 幼虫免疫组
阻动效价
150 100 50 0 0 2 4 6 8 时间（周） 10 12 14
皮肤培养液阻动效价的变化规律
皮肤培养液阻动效价的变化规律
整个实验过程中对照组鱼的皮肤培养液阻动效价水平都维持 在0~0.8之间，证明该组实验鱼在实验中没有被刺激隐核虫 感染过；体表感染组的实验鱼在接受初次免疫2周后皮肤培 养液阻动效价略有上升，再次免疫2周后，阻动效价显著上 升，在第14周达到峰值。
毕业论文答辩
刺激隐核虫幼虫诱导的斜带石斑鱼体液免 疫应答
姓名：梁富 指导老师：但学名
目
实验目的
实验的材料与方法 实验的数据结果 实验讨论
录
一 . 实 验 目 的
刺激隐核虫是一种纤毛类寄生虫，对水产养殖和观 赏鱼类造成了极大危害，在短时间内就会引发严重 感染和高死亡率，对经济生产造成了很大的损失。 近几年来，关于鱼类对对刺激隐核虫的免疫应答引 起了研究者的重视，刺激隐核虫幼虫免疫的石斑鱼 血清和粘液中都发现了特异性抗体，并具有很好的 免疫保护性 在感染后治疗过程中，相对于化学治疗来说，免疫 接种的方法是一种更为安全和有效的措施。
抗体对幼虫的阻动过程
三.实 验 结 果
在阻动实验中，当幼虫加入含有抗体的抗血
清或皮肤培养液中，一开始幼虫自由游动， 慢慢地其纤毛相互交联，游动速度逐渐变缓， 当它们游动过程中碰在一起时，彼此的纤毛 粘在一起，造成虫体凝集，失去自由运动能 力（图3-7），然后幼虫死亡，纤毛停止摆动， 最后胞膜破裂，原生质外流。
抗血清阻动效价的变化规律
抗血清阻动效价的变化规律
在整个实验过程中对照组鱼的抗血清阻动效价水平都保持稳 定，维持在0~1.2之间，证明该组实验鱼在实验中没有被刺 激隐核虫感染过；幼虫注射组的实验鱼在接受初次免疫2周 后血清抗体阻动效价就稍微上升，再次免疫2周后，血清抗 体阻动效价急速上升，在第6周达到峰值，然后开始略微下 降，第8~14周保持在一个较稳定的水平。