刺激隐核虫幼虫诱导斜带石斑鱼的体液免疫应答
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毕业论文答辩
刺激隐核虫幼虫诱导的斜带石斑鱼体液免 疫应答
姓名：梁富 指导老师：但学名
目
实验目的
实验的材料与方法 实验的数据结果 实验讨论
录
一 . 实 验 目 的
刺激隐核虫是一种纤毛类寄生虫，对水产养殖和观 赏鱼类造成了极大危害，在短时间内就会引发严重 感染和高死亡率，对经济生产造成了很大的损失。 近几年来，关于鱼类对对刺激隐核虫的免疫应答引 起了研究者的重视，刺激隐核虫幼虫免疫的石斑鱼 血清和粘液中都发现了特异性抗体，并具有很好的 免疫保护性 在感染后治疗过程中，相对于化学治疗来说，免疫 接种的方法是一种更为安全和有效的措施。
抗体对幼虫的阻动过程
三.实 验 结 果
在阻动实验中，当幼虫加入含有抗体的抗血
清或皮肤培养液中，一开始幼虫自由游动， 慢慢地其纤毛相互交联，游动速度逐渐变缓， 当它们游动过程中碰在一起时，彼此的纤毛 粘在一起，造成虫体凝集，失去自由运动能 力（图3-7），然后幼虫死亡，纤毛停止摆动， 最后胞膜破裂，原生质外流。
抗血清阻动效价的变化规律
抗血清阻动效价的变化规律
在整个实验过程中对照组鱼的抗血清阻动效价水平都保持稳 定，维持在0~1.2之间，证明该组实验鱼在实验中没有被刺 激隐核虫感染过；幼虫注射组的实验鱼在接受初次免疫2周 后血清抗体阻动效价就稍微上升，再次免疫2周后，血清抗 体阻动效价急速上升，在第6周达到峰值，然后开始略微下 降，第8~14周保持在一个较稳定的水平。
免疫应答过程进行研究，以期能找到具有最 高免疫原性和免疫保护性的免疫原，为以后 疫苗的研制与开发奠定基础。
二.实验材料与方法
实验鱼的来源、检测及驯养
→刺激隐核虫幼 虫的来源→ 实验分组→免疫方法→抗血清的 制备方法→皮肤培养液的制备方法→血清抗 体和皮肤培养液阻动效价的测定→幼虫对实 验鱼致死剂量的测定→ 攻毒→数据统计方法。
对照组 50 40 幼虫免疫组
阻动效价
30 20 10 0 1 2 3 4 5 时间（周ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 6 7 8
抗血清和皮肤培养液阻动效价的变化差异
腹腔注射幼虫后，实验鱼的抗血清和皮肤培养液的阻动效价 存在明显的差异：两者的最初生成时间、达到峰值的时间、 变化规律等都不一致，并且在实验过程中，皮肤培养液的阻 动效价一直显著低于抗血清的阻动效价。
抗血清 120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 时间（周） 10 12 14 皮肤培养液
阻动效价
致死剂量幼虫攻毒后各实验组鱼的死亡率
确定幼虫对卵形鲳鲹的致死剂量实验中，我们发现幼虫感染 剂量达到20×103个幼虫.鱼-1时就可以让全部的鱼死亡，因 此把致死剂量定为20×103个幼虫.鱼-1。经致死剂量幼虫感 染后各组实验鱼的死亡情况如表3所示。结果显示，对照组 的实验鱼在5 d之内全部死亡，而腹腔注射幼虫后最终死亡 率为60%，降低了40%。
四.讨论与实验意义
本研究的结果显示，腹腔注射刺激隐核虫幼虫能使 斜带石斑鱼的血清和皮肤培养液产生阻动隐核虫幼 虫的特异性抗体，并能使免疫鱼获得很好的免疫保 护，这意味着刺激隐核虫的全虫疫苗可以成为防治 海水白点病的一个有效途径。
与腹腔注射刺激隐核虫滋养体和包囊相比较，幼虫 引发的系统免疫应答强度（即抗血清的阻动效价） 和皮肤粘膜免疫应答强度（即皮肤培养液的阻动效 价）都显著增高，这说明幼虫的免疫抗原性要比滋 养体和包囊强得多。 刺激隐核虫生活史的三个发育阶段中，只有幼虫期 具有较好的免疫原性，而其它两个阶段免疫原性较 差。可以将幼虫期作为首选来研制灭活疫苗，为防 御和治疗刺激隐核虫病奠定了基础。所以，从我们 的研究结果来看，刺激隐核虫病的预防和防治应该 从幼虫期为出发，进行灭活疫苗疫苗或者基因工程 疫苗的研究。
对照组 200 幼虫免疫组
阻动效价
150 100 50 0 0 2 4 6 8 时间（周） 10 12 14
皮肤培养液阻动效价的变化规律
皮肤培养液阻动效价的变化规律
整个实验过程中对照组鱼的皮肤培养液阻动效价水平都维持 在0~0.8之间，证明该组实验鱼在实验中没有被刺激隐核虫 感染过；体表感染组的实验鱼在接受初次免疫2周后皮肤培 养液阻动效价略有上升，再次免疫2周后，阻动效价显著上 升，在第14周达到峰值。
刺激隐核虫的生活周期的四个阶段（见图示），我们采用的 是Colorni和Burgess(1997)的术语：滋养体(trophont)、胞 囊前体(protomont)、胞囊(tomont)和幼虫(theront)。
迄今为止，对刺激隐核虫生活史中各个阶段的免疫 应答研究尚未见报道。
本文就刺激隐核虫的幼虫阶段所引起的体液
刺激隐核虫幼虫诱导的斜带石斑鱼体液免 疫应答
姓名：梁富 指导老师：但学名
目
实验目的
实验的材料与方法 实验的数据结果 实验讨论
录
一 . 实 验 目 的
刺激隐核虫是一种纤毛类寄生虫，对水产养殖和观 赏鱼类造成了极大危害，在短时间内就会引发严重 感染和高死亡率，对经济生产造成了很大的损失。 近几年来，关于鱼类对对刺激隐核虫的免疫应答引 起了研究者的重视，刺激隐核虫幼虫免疫的石斑鱼 血清和粘液中都发现了特异性抗体，并具有很好的 免疫保护性 在感染后治疗过程中，相对于化学治疗来说，免疫 接种的方法是一种更为安全和有效的措施。
抗体对幼虫的阻动过程
三.实 验 结 果
在阻动实验中，当幼虫加入含有抗体的抗血
清或皮肤培养液中，一开始幼虫自由游动， 慢慢地其纤毛相互交联，游动速度逐渐变缓， 当它们游动过程中碰在一起时，彼此的纤毛 粘在一起，造成虫体凝集，失去自由运动能 力（图3-7），然后幼虫死亡，纤毛停止摆动， 最后胞膜破裂，原生质外流。
抗血清阻动效价的变化规律
抗血清阻动效价的变化规律
在整个实验过程中对照组鱼的抗血清阻动效价水平都保持稳 定，维持在0~1.2之间，证明该组实验鱼在实验中没有被刺 激隐核虫感染过；幼虫注射组的实验鱼在接受初次免疫2周 后血清抗体阻动效价就稍微上升，再次免疫2周后，血清抗 体阻动效价急速上升，在第6周达到峰值，然后开始略微下 降，第8~14周保持在一个较稳定的水平。
免疫应答过程进行研究，以期能找到具有最 高免疫原性和免疫保护性的免疫原，为以后 疫苗的研制与开发奠定基础。
二.实验材料与方法
实验鱼的来源、检测及驯养
→刺激隐核虫幼 虫的来源→ 实验分组→免疫方法→抗血清的 制备方法→皮肤培养液的制备方法→血清抗 体和皮肤培养液阻动效价的测定→幼虫对实 验鱼致死剂量的测定→ 攻毒→数据统计方法。
对照组 50 40 幼虫免疫组
阻动效价
30 20 10 0 1 2 3 4 5 时间（周ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 6 7 8
抗血清和皮肤培养液阻动效价的变化差异
腹腔注射幼虫后，实验鱼的抗血清和皮肤培养液的阻动效价 存在明显的差异：两者的最初生成时间、达到峰值的时间、 变化规律等都不一致，并且在实验过程中，皮肤培养液的阻 动效价一直显著低于抗血清的阻动效价。
抗血清 120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 时间（周） 10 12 14 皮肤培养液
阻动效价
致死剂量幼虫攻毒后各实验组鱼的死亡率
确定幼虫对卵形鲳鲹的致死剂量实验中，我们发现幼虫感染 剂量达到20×103个幼虫.鱼-1时就可以让全部的鱼死亡，因 此把致死剂量定为20×103个幼虫.鱼-1。经致死剂量幼虫感 染后各组实验鱼的死亡情况如表3所示。结果显示，对照组 的实验鱼在5 d之内全部死亡，而腹腔注射幼虫后最终死亡 率为60%，降低了40%。
四.讨论与实验意义
本研究的结果显示，腹腔注射刺激隐核虫幼虫能使 斜带石斑鱼的血清和皮肤培养液产生阻动隐核虫幼 虫的特异性抗体，并能使免疫鱼获得很好的免疫保 护，这意味着刺激隐核虫的全虫疫苗可以成为防治 海水白点病的一个有效途径。
与腹腔注射刺激隐核虫滋养体和包囊相比较，幼虫 引发的系统免疫应答强度（即抗血清的阻动效价） 和皮肤粘膜免疫应答强度（即皮肤培养液的阻动效 价）都显著增高，这说明幼虫的免疫抗原性要比滋 养体和包囊强得多。 刺激隐核虫生活史的三个发育阶段中，只有幼虫期 具有较好的免疫原性，而其它两个阶段免疫原性较 差。可以将幼虫期作为首选来研制灭活疫苗，为防 御和治疗刺激隐核虫病奠定了基础。所以，从我们 的研究结果来看，刺激隐核虫病的预防和防治应该 从幼虫期为出发，进行灭活疫苗疫苗或者基因工程 疫苗的研究。
对照组 200 幼虫免疫组
阻动效价
150 100 50 0 0 2 4 6 8 时间（周） 10 12 14
皮肤培养液阻动效价的变化规律
皮肤培养液阻动效价的变化规律
整个实验过程中对照组鱼的皮肤培养液阻动效价水平都维持 在0~0.8之间，证明该组实验鱼在实验中没有被刺激隐核虫 感染过；体表感染组的实验鱼在接受初次免疫2周后皮肤培 养液阻动效价略有上升，再次免疫2周后，阻动效价显著上 升，在第14周达到峰值。
刺激隐核虫的生活周期的四个阶段（见图示），我们采用的 是Colorni和Burgess(1997)的术语：滋养体(trophont)、胞 囊前体(protomont)、胞囊(tomont)和幼虫(theront)。
迄今为止，对刺激隐核虫生活史中各个阶段的免疫 应答研究尚未见报道。
本文就刺激隐核虫的幼虫阶段所引起的体液