第四章 沉淀法.

低。 在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离 子强度顺次进行。 每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心 收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度， 使另一种蛋白质组分盐析出来。 组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐 的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易 沉淀。
Cohn经验式
生物分离过程的一般流程
原料液 细胞分离(离心，过滤) 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 细胞破碎 碎片分离 路线一 路线二 清液－胞外产物
路线一A
粗分离(沉淀/超过滤/萃取)
纯化(层析、离子交换、吸附)
脱盐(凝胶过滤、超滤) 浓缩(超滤) 精制(结晶、干燥)
复性
本章主要内容
蛋白质溶解度与盐浓度的关系
㏒S=β-ＫsＩ
S—蛋白质的溶解度，g/L; I－离子强度，I=1/2∑mizi2 mi—离子i的摩尔浓度； Zi—所带电荷 β—常数，图中截距 Ks—盐析常数，图中直线斜率
初步纯化 ；
将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或
进一步处理。
沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法， 但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。
三、沉淀法操作步骤
①首先加入沉淀剂； ②沉淀剂的陈化，促进粒子生长； ③离心或过滤，收集沉淀物。
四、沉淀生成动力学
溶解度降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定 以后，分子互相碰撞并产生聚并作用。通常认为相 互碰撞由下面几种运动引起： ①热运动，Bromnian运动； ②对流运动，由机械搅拌产生； ③差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。
为了简化沉淀过程动力学，可把沉淀过程 分成下述６个步骤： (1) 初始混合 (2) 新相生成 (3) 布朗运动凝集 (4) 机械碰撞凝集 (5) 聚集体陈化 (6) 聚集体沉淀
五、沉淀法的特点
沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备， 且易于放大，也广泛用于生产，是分离纯化生物 大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。
于其它盐类：
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃
（NH4)2SO4
Na2SO4 NaH2PO4
70.6
4.9 1.6
75.4
18.9 7.8
95.3
43.3 93.8
103
42.2 101
硫酸铵的加入有以下几种方法：
1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积
四、影响盐析的因素
1、盐析用盐的选择


盐析作用要强
盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济

在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有 一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作 用较强，半径大的低价离子作用较弱。

柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCNNH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子 阴离子的影响子，避免了相互
碰撞，使蛋白质形成
稳定的胶体溶液。
2、蛋白质分子
间静电排斥作用。
蛋白质表面的电 荷与溶液中反离 子的电荷构成双 电层。
Salt induced precipitation
第二节 盐析
一、盐析的概念
在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生 物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生 沉淀的过程。
盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂。
（1）价廉； （2）溶解度大； （3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好； （4）不易引起蛋白质变性。
缺点： （1）水解变酸； （2）高pH 释氨，腐蚀； （3）残留产品有影响。
由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度，远远高
七、蛋白质的溶解特性

在水溶液中，疏水残基具有向内部折叠的趋势， 部分暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸 含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。
亲水残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。 因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成 荷电区、亲水区和疏水区构成。


1、蛋白质周围的水 化层（hydration
盐析是可逆的，而变性是不可逆的。
二、盐析法机理
（ 1 ）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量
盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化 力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失， 使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。
（ 2 ）破坏水化膜，暴露出憎水区域， 由于憎水
区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越 易沉淀。 质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降 低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而 沉淀。
第一节 沉淀法概述 第二节 盐析法 第三节 有机溶剂沉淀法 第四节 等电点沉淀法 第五节 其他沉淀方法 第六节 沉淀法应用
第一节 概述
一、沉淀法的概念
利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶
解度降低而形成无定形固体沉淀的过 程。
二、沉淀法的目的
浓缩；
有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，
的情况；速度不能太快，分批加入。搅拌需适中。
2）加入饱和溶液法 用于饱和度不高而原来溶液体积不大
的情况；可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。
3）透析平衡法 优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析
效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。
2、盐浓度对盐析效果的影响
一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越
（3）中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白
中性盐盐析法机理示意图
三、盐析过程
当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两 种情况： （1）“盐溶”现象(salt-in)—低盐浓度下，增加蛋 白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大 。 （2）“盐析”现象(salt-out)—高盐浓度下，中和 电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降 。
优点：操作简单、经济、浓缩倍数高 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择
性不强
六、沉淀法的分类
根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法； （4）非离子型聚合物沉淀法； （5）聚电解质沉淀法； （6）复合盐沉淀法等 （7）亲和沉淀法 （8）选择性沉淀法。