农杆菌转化法及转基因植物检测方法

农杆菌转化法及转基因植物检测方法

摘要：近年来，植物基因工程技术飞速发展，转基因植物在很多领域的研究推广取得了令人瞩目的成绩。植物基因工程中常用的转化方法一般是通过土壤农杆菌系统、植物病毒系统和DNA直接导入法这三种方法进行。另外，转基因技术快速发展的同时转基因植物检测技术也在不断地进歩和完善，目前被广泛应用的转基因植物检测方法有三类：整合水平上的检测、转录水平上的检测和表达水平上的检测。本文着重对农杆菌介导的植物转化方法和转基因植物的检测两方面进行综述。

关键词：农杆菌，转化，转基因植物，检测方法

伴随着生命科学的飞速发展，植物组织培养技术以及植物组织分化、植物基因重组等技术发展迅速并得到广泛应用。1984年转基因烟草的诞生[1]，使外源基因导入植物细胞从而获得转基因新品种的设想成为现实。随后，转基因技术被广泛应用于各个方面如：植物新品种的改良、植物性状改良、植物抗性的提高以及植物基因功能的研究等[2-4]。新型转基因大豆、转基因番茄及转基因玉米等转基因新品种陆续面世[5]。植物转基因技术不但能够打破植物的物种界限，还能够使物种基因彼此进行交流。使植物育种年限缩短，植物育种进程加快，植物抗性也在一定程度上得到很大提高，使来自于不同生物种类的优良目的基因导入植物并得到优良植物新品种。同时，运用转基因技术研究植物自身基因结构组成及其基因功能调控等方面也取得了一定成果；运用转基因技术还研制出生物反应器和雄性不育系[6]。

目前，利用转基因技术将目的基因导入植物基因组中的常用方法主要有：土壤农杆菌介导的基因转化、DNA直接导入和植物病毒系统介导法。本文着重介绍土壤农杆菌介导的目的基因转化法，同时也对目前转基因植物的检测进行适当总结。

1 土壤农杆菌介导系统的种类

土壤农杆菌中的发根农杆菌和根癌农杆菌能够侵染植物伤口并形成与土壤农杆菌中大质粒有关的植物肿瘤和冠瘿。能够诱发此类肿瘤的根瘤农杆菌中常常

带有分子量为200-250kb的Ti质粒。研究者对不同株系的根癌农杆菌进行比较得出结论：Ti质粒通常有四个同源区，T-DNA和Vir区与植物肿瘤的形成有关，另外两个区与目的基因的接合转移以及质粒自身复制有关。根癌农杆菌中的T-DNA进入植物细胞后，可以自行插入植物染色体的基因组，改变基因组结构组成。而发根农杆菌侵染寄主植物后，Ri质粒将会诱发植物被侵染部位产生大量毛状根。

1.1 Ti质粒载体系统

根癌农杆菌侵染植物细胞时将根癌农杆菌Ti质粒上的T-DNA插入植物基因组中，以此来改变植物基因组的组成。位于T-DNA上的基因能够编码控制植物生长素和植物细胞分裂素的合成，使被侵染的植物细胞过度增殖而产生瘤。同时T-DNA编码合成的Opines化合物，可以被农杆菌利用并作为碳氮来源。因此农杆菌和寄主植物能够形成彼此互利和共生的密切关系。大量研究数据表明，农杆菌中负责T-DNA转移的有三种组分：Ti质粒上的T-DNA、Ti质粒上的vir基因序列和chv基因序列。由25个不完整的碱基对顺向重复构成了T-DNA，通常T-DNA编码产生的基因序列不能促使自身转移，因此在插入目的基因的过程中可以去掉T-DNA原有内部基因；vir基因序列通常位于T-DNA外。寄主植物被农杆菌侵染后，伤口会分泌出许多化合物，这些化合物与编码vir基因的蛋白质发生反应，产生T-DNA拷贝并被导入寄主细胞中。Chv基因通常与细菌趋化性和受伤植物细胞粘附性有关，与T-DNA的转移也有着密切联系。但在转基因过程中，将野生型Ti质粒作为植物载体存在着很多弊端：Ti质粒的分子量过大，常规实验方法难以操作，在T-DNA片段上无法找到用于插入外源DNA片段的单一限制性内切酶位点；另外将可能诱发冠瘿病的Ti质粒导入健康的植物细胞组织后，很大可能会导致植物的病态。因此，经过改良后的Ti质粒才能够被运用于基因克隆中。目前，对野生型Ti质粒进行改良得到两种载体系统：共和载体系统和双元载体系统。

1.1.1 共和载体系统

共和载体系统又被称作one-载体法，此方法将Ti质粒作为给体载体，利用给体载体上的Vir区域进行T-DNA转移。将外源目的基因与大肠杆菌的常用质粒pBR322进行连接，形成中间载体，将给体载体与中间载体进行同源重组以此

替代给体载体中可缺失的T-DNA片段，最终形成共合体载体。共和载体中包含了目的基因片段及全部的中间质粒片段，这样会导致后期的结果分析复杂化。而隔端载体的出现很好地解决了这一难题。隔端载体是将两个T-DNA上的LB和RB分别放置于给体载体和中间载体上，进行同源重组后，目的基因便只存在于转移片段上，此方法优化了装个转化体系[7]。

1.1.2 双元载体系统

双元载体系统由辅助载体和双向载体两个载体组成，这两种载体是彼此相容的两个Ti质粒。辅助载体上的Vir区域可辅助T-DNA的转移，双向载体通常寄主范围广，带有T-DNA片段并可作为DNA转移载体。当外源基因连接到双向载体后，双向载体因其分子量小具备易于复制的优点，在大肠杆菌中大量复制，从而得到更多的目的基因。双元载体在不用构建质粒共合体的同时避免了共和载体系统可能出现的同源区问题。双元载体上的多克隆位点和植物选择标记基因有利于后期的植物筛选，细菌选择标记基因有利于对转化菌种的选择，达到了“三菌结合”。

随着双元载体系统的快速发展，PART27通用双元载体质粒应运而生。该质粒上带有CaMV35S启动子、RK和ColEl复制子、多克隆位点以及章鱼碱合成酶基因的转录终止序列，其中RK和ColEl复制子能够应用于高拷贝复制中。此外PART27通用双元载体质粒上的壮观霉素和链霉素抗性基因可以辅助在大肠杆菌中的筛选。当今，双元载体系统在农杆菌介导系统中已被广泛应用[8]。

1.2 Ri质粒载体系统

发根农杆菌中的Ri质粒可以构建出完整的onc+载体，Ti质粒则不能进行。发根农杆菌侵染植物时，在Ri质粒的诱导作用下，伤口产生大量毛状根，毛状根在植物激素的进一歩作用下分化，形成可育的完整个体。但目前对于发根农杆菌中的Ri质粒的研究还只停留在研究次生代谢物和根瘤形成原因上，Ri质粒系统的研究较少。

1.3 根癌农杆菌的转化方式

根癌农杆菌侵染植物细胞后，将T-DNA导入植物基因组中，这个过程非常复杂。植物伤口处会分泌一些小分子酚类化合物，这些化合物能够将农杆菌粘连