细胞膜色谱法在中药中的应用

仪器分析选论综述
（2014 ）级
综述题目：细胞膜色谱法在中药中的应用
学院：中药学院
专业：中药学
学号： 2111448008
姓名：王利
2014年12月
细胞膜色谱法在中药中的应用
摘要：细胞膜色谱法( cell membrane chromatography，CMC)是由贺浪冲教授在1996年创建的一种新型的具有生物活性的亲和色谱技术。

该技术将高效液相色谱、细胞生物学与受体药理学结合起来，通过将活性细胞膜固定在特定载体表面，制备成细胞膜固定相，用液相色谱的方法研究药物与固定相上细胞膜及膜受体的相互作用，利用药物与膜受体间存在的特异亲和力，将药物在体内的作用过程在色谱柱内进行动态模拟[1]。

文章针对CMC的原理、特性及在中药等方面的应用进行概述，为进一步研究和开发利用CMC提供理论依据。

关键词：细胞膜色谱法；原理；特性；中药应用
1细胞膜色谱法介绍
1.1原理和特点
CMC是将活性细胞膜结合到硅胶载体的表面，制成细胞膜固定相(cellmembrane stationary phase，CMSP)，利用色谱学技术研究流动相中药物与受体相互作用规律的受体动力学新方法。

该法将高效液相色谱、细胞生物学与受体药理学相结合，利用药物与膜受体间存在的特异性亲和力，成功的将药物在体内的作用过程在色谱柱内进行动态模拟。

CMC系统以缓冲溶液为流动相，药物为溶质或添加在流动相中，用液相色谱法在动态条件下研究药物与固定相上细胞膜及受体的相互作用，所得到的色谱参数如容量因子kc、不对称因子As等，对研究药物作用机制、药物与受体亲和作用及新药筛选等具有重要参考价值。

基于上述原理，CMC具有以下特点：CMC可在动态条件下反映受体与配体结合的特异性、饱和性、可逆性和竞争性等特点，并具有手性识别能力；CMC具有操作简便、稳定可靠、高效灵敏等优点；CMSP具有色谱分离和细胞膜活性二重特性，色谱分离和活性筛选可同步完成[2]。

1.2细胞膜色谱模型建立的方法
目前细胞膜色谱模型的建立方法主要包括两种：(1)是硅胶载体细胞膜(carrier cell membrane，CCM)，即以硅胶为载体，用吸附法将活性细胞膜固定在其表面，该方法最大限度地保持了细胞膜的整体性、膜受体的立体结构、周围环境和酶活性，具备普通细胞膜制剂的特性。

以K+、Na+-三磷酸腺苷(K+、Na+-ATP)酶作为活性指标，采用电子显微镜和表面能谱技术对硅胶CCM的表面特性进行分析，通过比较硅胶CCM与悬液细胞膜和沉淀状细胞膜的酶活性随温度、时间的变化规律和稳定性，以证明硅胶CCM与其他两种赋存状态的细胞膜一样，具有可比较的酶活性特征。

由硅胶CCM制成的色谱固定相，可直接用于研究药物与膜受体相互作用的特异性和立体选择性，
由此得到的色谱参数对研究药物作用机制和新药开发与筛选有重要参考价值[3-4]；(2)是直接取用效应器官的细胞膜和中药提取液在适宜培养基中共同孵育一段时间，利用活性细胞膜去固相化中药的成分，使效应成分与细胞膜进行特异性结合，再进行分离鉴定。

经多次洗涤药物作用后的细胞膜，可以排除大量非作用成分的干扰，是研究中药效应成分的有效手段[5]。

1.3细胞膜色谱法的主要流程
主要流程包括：(1)分离活性细胞膜；(2)固定化活性细胞膜；(3)制备细胞膜色谱柱；(4)细胞膜色谱分离、分析，研究化合物与细胞膜受体相互作用特性[6]。

2细胞膜色谱法在中药中的应用
目前，CMC法已成功应用于中药药效物质基础研究及质量控制、单体化合物活性筛选、药物与受体及受体亚型亲和作用研究等方面。

2.1用于中药复杂体系中活性成分的筛选
中药及药用植物中化学成分复杂，应用天然药物提取分离方法筛选其中特定的有效成分周期长，命中率相对较低，而CMC不经提取分离步骤，直接在CMC模型上筛选药物的活性部位和活性成分[7]。

直到现在，细胞膜色谱技术仍是非常新颖、有效的中药活性成分筛选技术，其以现代分子药理为依据，以色谱、质谱为技术支持，特异性识别与细胞发生亲和、吸附、锚定的活性成分，巧妙地将两个复杂体系(中药体系、生物体系)客观地联系起来[8]。

应用细胞膜色谱技术，可将中药或中药复方中的效应物质进行分离，使活性成分的分离和筛选结合在一起，克服了以往先从中药中分离有效部位或单体，再分析其药效，从而避免了成分分离和药效筛选脱节的弊端。

该技术能较快的明确中药药效物质基础，并可通过制备型HLLC尽可能多的富集效应成分，以进行药理活性验证，便于活性追踪，在实验过程中加入阳性对照药或工具药进行药效学验证，使结合更具可信性，更易于评价药物的作用。

细胞膜色谱技术由于固定相能够特异、选择性地与活性成分结合，可以排除非作用杂质成分的干扰，是一种快速、高效的筛选方法。

由此可见细胞膜色谱技术为中药的活性成分筛选提供了一种思路和手段，具有良好的发展前景[9]。

赵惠茹，杨广德[10]等人采用细胞膜色谱法(CMC)筛选，薄层层析法分离，并结合离体药理实验确定当归中的有效成分。

结果与结论：血管CMC模型基本可以反映化合物与细胞膜及膜蛋白(包括受体)的相互作用；化合物在CMC体系中的保留特性和其药理作用有显著的相性；DG-2是当归中对血管有舒张作用的有效部位，而DG-21则是其有效成分。

王嗣岑[11]等人应用A431细胞膜色谱在线与液相色谱质谱联用，从中药苦参中筛选出EGFR受体抑制剂苦参碱和氧化苦参碱，并应用竞争实验证明了苦参碱和氧化苦参碱的作用位点确实是EGFR受体，并利用体外细胞培养的
方法，做了离体药理实验，证明了经过识别-分离-鉴定后的这两种化合物却能阻断EGFR受体。

王艳微，畅瑞苗[12] 细胞膜色谱法与液相色谱-质谱联用筛选佛手的活性成分，VSM/CMC和LC/MS 技术联用，为从天然产物中快速寻找新的活性成分提供了途径。

李淼[13]等人应用VEGFR-2受体高表达细胞的细胞膜色谱在线与液相色谱质谱联用，从中药乌头中新乌头碱、乌头碱、次乌头碱活性化合物，并通过细胞生长和离体药理实验证明了识别出活性化合物的药理作用。

2.2用于中药复方的物质基础分析
应用细胞膜色谱技术，能够对中药复方的中各味中药进行拆分分析。

梁明金[14]等利用细胞膜色谱筛选技术并结合离体药理试验，对宋代经典名方“四物汤”(熟地黄、当归、白芍、川芎)中各位中药进行拆分分析，发现当归脂溶性部分中含有明显扩张血管作用的有效成分，并结合了GC-MS联用法分离鉴定了当归中的有效成分。

细胞膜色谱法的此种用途将对中药复方的复杂体系的物质基础研究起到巨大的作用，加快了中药现代化的进程。

2.3用于中药及其复方制剂的质量控制
通常的中药质量控制方法存在检测指标单一，质控指标与药效作用相关性不强等问题，一般很难全面有效地控制中药质量。

中药质量控制的目的是确保中药使用的安全性和有效性，因此只有被分析对象能够全面反映其质量，控制技术或方法才能发挥作用，从而实现中药的稳定、可控[15]。

朱丽华[16]等人应用反相高效液相色谱技术(RP-HPLC)与CMC法对葛根有效部位(醋酸乙脂提取部位)进行指纹图谱定性分析，对葛根有效部位中的有效成分(葛根素和大豆苷元)进行了定量测定。

李洪玲[17]等人对中药复方制剂心康平的质控指标进行研究。

心康平系由丹参、三七和当归为主要有效部位组成的新复方制剂。

各有效部位的确定采用了犬心肌、大脑和血管细胞膜受体筛选技术[18]。

研究发现了丹参的脂溶性部位对心肌、三七的水溶性部位对大脑、当归的发挥油对血管[19]有较强的选择作用。

2.4用于研究中药药物与受体的亲和作用
CMC法实质上是一种新的具有生物活性的仿生色谱系统，药物分子与细胞膜及膜受体（配体-靶体）间的动态相互作用特性，仍然可以用前沿色谱的方法分析，通过制作药物分子的突破曲线，并由以下关系计算出配体的Kd值。

杜晖[20]等人应用平滑肌细胞膜色谱研究了左型钙离子通道受体类药物与受体的亲和解离常数，通过高效液相色谱研究受体与配体的特异结合，细胞膜色谱方法简便易行，使受体研究和药物筛选效率得到提高，杜晖等人还将细胞膜色谱法和RBA法进行比较，得出用细胞膜色谱法求得的亲和解离常数和用RBA方法测得的放射性亲和力排序完全相同，并具有明显的相关性。

长期以来研究药物与受体相互作用一直运用细胞膜放射性配体分析技术(RBA)和离体器官受体功能分析方法。

其中RBA法不能直接反应药物与受体作用的类型和立体
选择性，而且对环境造成同位素污染，离体器官受体功能分析法的研究效率较低。

张延妮[21]等人通过4种川芎化学成分在心肌细胞膜固定相色谱柱上的保留性，研究其与心肌细胞受体的作用。

已完成的大量实验显示：CMC法可以反映药物与受体特异性、竞争性和饱和性结合；细胞膜色谱参数容量因子可在一定程度上反映药物和受体的亲和力，两者之间存在正相关关系；CMC保留参数的大小除了与药物亲和力大小有关外，可能还受其他因素如化合物极性的大小影响[22]。

展望
CMC反映了小分子化合物与膜受体蛋白分子间的相互作用，它的结合具有特异性、适用性、饱和性、多靶标性、可逆性和竞争性结合等特点，CMC法可从中药复杂体系中筛选发现有药理活性作用的目标组分，并以目标组分和其它相关组分，同时作为中药定性和定量的指标成分，结合中药指纹图谱、一测多评等技术，可以更加有效地控制中药及其制剂的质量。

另外，CMC法还可通过筛选发现中药注射剂中可能的致敏物来监控注射剂的生产过程和最终产品，以提高中药注射剂的安全性。

CMC测定过程快捷方便，表现出高稳定性、高重复性、高特异性和色谱柱可重复使用等优点；并且该系统容易实行自动化加样、测定和分析。

将CMC用于药用植物和中药现代化物质基础研究，筛选和发现天然药物中的有效部位和有效成分，将有望实现中药的高通量筛选。

近年来，CMC在药物筛选和开发研究中的作用越来越显著。

CMC不仅在研究药物与受体相互作用方面，而且在中药活性部位和活性成分筛选方面都证明是一种高效、高水平、高选择性的分析方法。

由CMC模型获得的色谱保留参数与药物的药理作用密切相关，可简捷快速分离出中药复杂体系中的活性成分。

采用CMC、色谱-质谱联用并结合超临界流体萃取和高效液相色谱纯化技术筛选、分离和鉴定中药中的有效成分。

将为中药现代化物质基础研究和中药产品的质量控制提供一种有效的技术平台。

随着生物与分析技术的发展，CMC法将不断完善和提高，并更加专门化和智能化，为全面中药质量控制发挥一点作用。

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