O型口蹄疫抗体3种不同检测方法的对比与分析_江涛
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血清样品： 本试验选取固始县临床采集的、免疫 背景清楚的血清样本共 326 份，其中猪血清 197 份， 羊血 55 份，牛血清 74 份。
试剂： 正向间接血凝 （ IHA） 试剂盒、液相阻断 ELISA （ LPB － ELISA） 试剂盒均购自兰州兽医研究 所，间接 ELISA 抗 体 检 测 试 剂 盒 购 自 国 内 某 生 物 公司。 1. 2 检测方法及结果判定
收稿日期： 2014 － 06 － 05
O 型口蹄疫抗体 3 种不同检测方法的对比与分析
江涛，崔峰瑞，任灵芝
（ 河南省固始县动物疫病预防控制中心，河南 固始 465200）
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性热性传染 病。该病易感动物种类多、传播途径多、传播迅速、 发病控制难度大，给世界养殖业造成巨大经济损失， 被世界动物卫生组织 （ OIE） 列为通报疫病，在我国 也被列为 1 类传染病，同时纳入强制免疫疫病。农业 部明确提出将口蹄疫合格率作为防疫工作的重要考核 指标，但在实际监测工作开展中经常会碰到一些问 题。为提高检测结果准确性，结合操作技能要求，我 们选择了正向间接血凝 （ IHA） 、间接 ELISA、液相 阻断 ELISA 3 种方法进行比对试验，现将试验结果分 析总结，以供参考。 1 材料与方法 1. 1 材料
通过对商品公羊的全程生长规律的分析，增重速 度最快的时期在 3 到 7 月龄，8 月龄出现生长转折，
生长速度开始下降，9 月龄之后生长缓慢。因此，在 3 至 7 月龄期间应作为饲养重点，加强营养以加速 生长。
根据饲养效益和商品公羊的成熟度分析，公羊饲 养到 10 月龄时建议出栏上市。这时的体重可达到 45 kg 以上，已基本接近成年商品公羊的平均体重，也 不影响湖羊的屠宰率，是商品湖羊最适宜出栏时期。
收稿日期： 2014 － 07 － 18
待检血清分别利用上述 3 种方法进行检测，统计 结果以 IHA 方法检测结果为参照，分析 3 种方法的 合格率及附合度。比对试验样品检测所用试剂均在有 效期内，检测操作按说明书进行，各试剂检测对照均 成立，检验结果按试剂盒要求判定。 2 结果
利用 3 种方法分别对采集血清样本检测，结果表 明 3 种检测方法中，IHA 方法检测结果阳性率最低， 尤其是猪的 IHA 阳性率显著低于间接 ELISA 阳性率 （ P ＜ 0. 05） ，具体见表 1。
≤1： 4
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1： 8 ～ 1： 16 25
0a
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1
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3
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≥1： 64 88
88
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61
61
61
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37
37
37
37
3 讨论 检测统计结果表明，虽然 3 种检测方法结果符合
度较高，但合格率或阳性率之间还存在着差异。检测 结果中，IHA 检测阳性率最低，这与国内其他研究报 道有所不同。且不同畜种类别也有偏差，出现差异的 部分主要表现在免疫不合格的样品上。
两种 ELISA 检测方法也存在结果上的差异，可 能是因为液相阻断 ELISA 对待检血清中抗体选择更 严格。在液相阻断 ELISA 检测中，定量的口蹄疫病
毒抗原与待检血清样品中的抗体结合后，抗原表位被 封闭而不能再与固相化兔抗口蹄疫抗体结合。这就要 求待检样品中的抗体与口蹄疫病毒抗原结合要有高的 亲和力及精确的结合位点，提高了检测的特异性，这 也就是与间接 ELISA 检测结果存在差异的主要原因。
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Animal Husbandry ＆ Veterinary Medicine 2015 Vol. 47 No. 5
表 1 3 种方法检测猪、牛、羊血清样品结果统计
畜别 猪 牛 羊
合计
样本数 197 74 55 326
阳性结果符合数 129 61 37 227
IHA 阳性率 / % 65. 48a 82. 43 67. 27 69. 63a来自百度文库
LPB － ELISA 阳性率 / % 73. 60ab 83. 78 76. 36 76. 38ab
间接 ELISA 阳性率 / % 76. 65b 83. 78 78. 18 78. 53b
注： 表中阳性率肩标相同字母表示差异不显著 （ P ＞ 0. 05） ； 肩标不同字母表示差异显著 （ P ＜ 0. 05） ，下同
畜牧与兽医 2015 年 第 47 卷 第 5 期
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图 1 不同月龄的平均体重、日增重和相对生长率
公湖羊的饲养效益从断奶当月至 7 月龄效益最为 显著，回报率达 200% 以上，8 月龄后回报率下降但 仍保持有盈利，到 9 月龄后开始出现负效益。 3 讨论
无论是日增重、相对生长率还是效益对比，断奶 后的一个月内表现最为显著，这与哺乳的后续效应有 极大的关系，说明母乳营养对羔羊后期生长发育的重 要性。
总之，免疫接种是预防口蹄疫病的最有效的措 施。口蹄疫抗体监测是口蹄疫疫苗应用效果评估、指 导免疫程序制定的重要参考指标，因此选择合适的检 测方法是监测工作的重中之重。IHA 检测方法操作比 较简便、时长 3 h 左右、容易推广，但结果判定主观 性偏强。LPB － ELISA 检测结果判定较客观，但操作 繁杂、耗时长，且部分检测试剂对人和环境有危害。 间接 ELISA 方法在大批量样本检测中更具优势，但 其检测结果只是定性判断，在研究疫苗抗体产生规律 及制定免疫程序方面有一定的局限性，能否取代经典 的 IHA 方法，仍需进一步探索。以上 3 种方法根据 实际情况加以灵活应用，不仅能够保证免疫监测工作 高质量完成，而且能为防制口蹄疫提供可靠的依据， 同时还可以解决试剂经费供应紧张等问题。
IHA 用于检测口蹄疫抗体已有较长时间，且基层 人员都已基本掌握，并得到了广泛应用，其 IHA 抗体 效价的临床意义比较明确，于是将其设为标准，按 IHA 方法检测效价将样品分为 4 个区间，分别比较不 同效价的血清样本 LPB － ELISA、间接 ELISA 和 IHA
的符合度，结果表明： 检测样品抗体水平较高 （ IHA 检测抗体效价≥1： 64） 和较低 （ ≤1： 4） 时 3 种检 测方法结果完全一致。中间值时有不同程度差别，猪 样本在 1： 8 ～ 1： 16 时有明显差异 （ P ＜ 0. 05），详 见表 2。
表 2 3 种方法检测血清样品结果统计
IHA 检测效价 样本 数
猪 IHA LPB － ELISA间接 ELISA 样本 阳性数 阳性数 阳性数 数
牛 IHA LPB － ELISA间接 ELISA 样本 阳性数 阳性数 阳性数 数
羊 IHA LPB － ELISA间接 ELISA 阳性数 阳性数 阳性数
3 种方法检测结果均比较理想，但影响检测结果 的因素较多，且方法不同影响程度也不一样，主要影 响因素有：
IHA 检测方法易受到试剂质量、人员操作和主观 判定等因素的影响。IHA 检测的条件看似简单，实际 上对检测人员经验、环境温度及样品中抗体的浓度都 有严格的要求，近些年 IHA 检测试剂盒的说明书内 容不断在改进也映证了上述观点。此外，在用 IHA 方法检测时，由于待检血清样本的抗体水平较高，抗 原抗体反应易形成钩状效应的前带现象。为解决这个 问题，就需将血清作基础稀释后再做 IHA 检测或者 将血清样本作系列浓度稀释后用 ELISA 方法检测。
试剂： 正向间接血凝 （ IHA） 试剂盒、液相阻断 ELISA （ LPB － ELISA） 试剂盒均购自兰州兽医研究 所，间接 ELISA 抗 体 检 测 试 剂 盒 购 自 国 内 某 生 物 公司。 1. 2 检测方法及结果判定
收稿日期： 2014 － 06 － 05
O 型口蹄疫抗体 3 种不同检测方法的对比与分析
江涛，崔峰瑞，任灵芝
（ 河南省固始县动物疫病预防控制中心，河南 固始 465200）
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性热性传染 病。该病易感动物种类多、传播途径多、传播迅速、 发病控制难度大，给世界养殖业造成巨大经济损失， 被世界动物卫生组织 （ OIE） 列为通报疫病，在我国 也被列为 1 类传染病，同时纳入强制免疫疫病。农业 部明确提出将口蹄疫合格率作为防疫工作的重要考核 指标，但在实际监测工作开展中经常会碰到一些问 题。为提高检测结果准确性，结合操作技能要求，我 们选择了正向间接血凝 （ IHA） 、间接 ELISA、液相 阻断 ELISA 3 种方法进行比对试验，现将试验结果分 析总结，以供参考。 1 材料与方法 1. 1 材料
通过对商品公羊的全程生长规律的分析，增重速 度最快的时期在 3 到 7 月龄，8 月龄出现生长转折，
生长速度开始下降，9 月龄之后生长缓慢。因此，在 3 至 7 月龄期间应作为饲养重点，加强营养以加速 生长。
根据饲养效益和商品公羊的成熟度分析，公羊饲 养到 10 月龄时建议出栏上市。这时的体重可达到 45 kg 以上，已基本接近成年商品公羊的平均体重，也 不影响湖羊的屠宰率，是商品湖羊最适宜出栏时期。
收稿日期： 2014 － 07 － 18
待检血清分别利用上述 3 种方法进行检测，统计 结果以 IHA 方法检测结果为参照，分析 3 种方法的 合格率及附合度。比对试验样品检测所用试剂均在有 效期内，检测操作按说明书进行，各试剂检测对照均 成立，检验结果按试剂盒要求判定。 2 结果
利用 3 种方法分别对采集血清样本检测，结果表 明 3 种检测方法中，IHA 方法检测结果阳性率最低， 尤其是猪的 IHA 阳性率显著低于间接 ELISA 阳性率 （ P ＜ 0. 05） ，具体见表 1。
≤1： 4
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3 讨论 检测统计结果表明，虽然 3 种检测方法结果符合
度较高，但合格率或阳性率之间还存在着差异。检测 结果中，IHA 检测阳性率最低，这与国内其他研究报 道有所不同。且不同畜种类别也有偏差，出现差异的 部分主要表现在免疫不合格的样品上。
两种 ELISA 检测方法也存在结果上的差异，可 能是因为液相阻断 ELISA 对待检血清中抗体选择更 严格。在液相阻断 ELISA 检测中，定量的口蹄疫病
毒抗原与待检血清样品中的抗体结合后，抗原表位被 封闭而不能再与固相化兔抗口蹄疫抗体结合。这就要 求待检样品中的抗体与口蹄疫病毒抗原结合要有高的 亲和力及精确的结合位点，提高了检测的特异性，这 也就是与间接 ELISA 检测结果存在差异的主要原因。
156
Animal Husbandry ＆ Veterinary Medicine 2015 Vol. 47 No. 5
表 1 3 种方法检测猪、牛、羊血清样品结果统计
畜别 猪 牛 羊
合计
样本数 197 74 55 326
阳性结果符合数 129 61 37 227
IHA 阳性率 / % 65. 48a 82. 43 67. 27 69. 63a来自百度文库
LPB － ELISA 阳性率 / % 73. 60ab 83. 78 76. 36 76. 38ab
间接 ELISA 阳性率 / % 76. 65b 83. 78 78. 18 78. 53b
注： 表中阳性率肩标相同字母表示差异不显著 （ P ＞ 0. 05） ； 肩标不同字母表示差异显著 （ P ＜ 0. 05） ，下同
畜牧与兽医 2015 年 第 47 卷 第 5 期
155
图 1 不同月龄的平均体重、日增重和相对生长率
公湖羊的饲养效益从断奶当月至 7 月龄效益最为 显著，回报率达 200% 以上，8 月龄后回报率下降但 仍保持有盈利，到 9 月龄后开始出现负效益。 3 讨论
无论是日增重、相对生长率还是效益对比，断奶 后的一个月内表现最为显著，这与哺乳的后续效应有 极大的关系，说明母乳营养对羔羊后期生长发育的重 要性。
总之，免疫接种是预防口蹄疫病的最有效的措 施。口蹄疫抗体监测是口蹄疫疫苗应用效果评估、指 导免疫程序制定的重要参考指标，因此选择合适的检 测方法是监测工作的重中之重。IHA 检测方法操作比 较简便、时长 3 h 左右、容易推广，但结果判定主观 性偏强。LPB － ELISA 检测结果判定较客观，但操作 繁杂、耗时长，且部分检测试剂对人和环境有危害。 间接 ELISA 方法在大批量样本检测中更具优势，但 其检测结果只是定性判断，在研究疫苗抗体产生规律 及制定免疫程序方面有一定的局限性，能否取代经典 的 IHA 方法，仍需进一步探索。以上 3 种方法根据 实际情况加以灵活应用，不仅能够保证免疫监测工作 高质量完成，而且能为防制口蹄疫提供可靠的依据， 同时还可以解决试剂经费供应紧张等问题。
IHA 用于检测口蹄疫抗体已有较长时间，且基层 人员都已基本掌握，并得到了广泛应用，其 IHA 抗体 效价的临床意义比较明确，于是将其设为标准，按 IHA 方法检测效价将样品分为 4 个区间，分别比较不 同效价的血清样本 LPB － ELISA、间接 ELISA 和 IHA
的符合度，结果表明： 检测样品抗体水平较高 （ IHA 检测抗体效价≥1： 64） 和较低 （ ≤1： 4） 时 3 种检 测方法结果完全一致。中间值时有不同程度差别，猪 样本在 1： 8 ～ 1： 16 时有明显差异 （ P ＜ 0. 05），详 见表 2。
表 2 3 种方法检测血清样品结果统计
IHA 检测效价 样本 数
猪 IHA LPB － ELISA间接 ELISA 样本 阳性数 阳性数 阳性数 数
牛 IHA LPB － ELISA间接 ELISA 样本 阳性数 阳性数 阳性数 数
羊 IHA LPB － ELISA间接 ELISA 阳性数 阳性数 阳性数
3 种方法检测结果均比较理想，但影响检测结果 的因素较多，且方法不同影响程度也不一样，主要影 响因素有：
IHA 检测方法易受到试剂质量、人员操作和主观 判定等因素的影响。IHA 检测的条件看似简单，实际 上对检测人员经验、环境温度及样品中抗体的浓度都 有严格的要求，近些年 IHA 检测试剂盒的说明书内 容不断在改进也映证了上述观点。此外，在用 IHA 方法检测时，由于待检血清样本的抗体水平较高，抗 原抗体反应易形成钩状效应的前带现象。为解决这个 问题，就需将血清作基础稀释后再做 IHA 检测或者 将血清样本作系列浓度稀释后用 ELISA 方法检测。