肌肉疾病基因功能研究介绍

肌肉疾病基因功能研究介绍

我们常遇到的肌肉疾病主要包括杜氏肌营养不良症（Duchenne Muscular Dystrophy, DMD），Becker型肌营养不良(Becker Muscular Dystrophy, BMD) , 脊髓性肌萎缩(spinalmuscularatrophy, SMA)和肌萎缩性侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）等。

DMD和BMD都属于X染色体隐性遗传，Duchenne型发病率最高，病情最严重，是遗传性肌萎缩症中最有代表性的疾病。DMD也是人体最大的基因，由DMD基因功能丧失引起，可以通过基因治疗技术手段治疗。SMA是常染色体隐性遗传，由SMN基因缺陷、运动神经元丧失引起，可以通过基因治疗的方式来治愈，多发生在婴幼儿。ALS也称为运动神经元病（MND），它是上运动神经元和下运动神经元损伤之后，导致包括球部（即延髓支配的这部分肌肉）、四肢、躯干、胸部腹部的肌肉逐渐无力和萎缩，病因至今不明。

神经肌肉萎缩患者大部分是缓慢起病，神经肌肉萎缩患者往往出现四肢肌肉无力、萎缩，也可有麻木、易疲劳、肌肉疼痛等症状;有的患者还有眼肌、咽喉肌的无力，出现视物重影、眼球活动障碍、发音和吞咽困难等症状，严重者无法吞咽，甚至可能因呼吸肌无力而死亡。

1、这些疾病中主要集中在DMD和SMA疾病，模型分别为：

DMD: DMD小鼠模型mdx小鼠，原理为：编码抗肌萎缩蛋白基因的第3185位基因自发突变，由C-T，致使原本编码谷氨酰胺的密码子变成了终止密码子，基因表达提前终止，导致DMD功能缺陷。

SMA: SMA模型鼠，通常是SMN1和SMN2双基因缺陷小鼠。

ALS：SOD1突变相关的ALS小鼠模型（比如突变SOD1 转基因小鼠等）

2、疾病模型干预处理—病毒选择

目前主流的三大病毒载体：慢病毒、腺病毒、AA V（腺相关病毒）。

慢病毒腺病毒腺相关病毒

特点与肌肉应用感染表达范围广泛，

对培养的肌肉细胞和

肌肉干细胞（如卫星

细胞）均能高效感染感染能力强，特别适

合于原代细胞（如原

代心肌细胞等）的感

染

安全性及高；免疫原

性低，长效表达（稳

定表达3-6个月）；

病毒颗粒小，感染均

一性高；注射方式多

样

肌肉应用局限对肌肉组织的感染表

达非常有限免疫原性高，可能引

发强烈的免疫反应；

大分子容易被清除，

表达周期短，大约2

周时间；较少被应用

于肌肉组织的靶向表

达

表达到高峰所需的时

间长、载体容量小

表1 三种病毒的应用比较

慢病毒：感染表达范围广泛，对培养的肌肉细胞均能高效表达，但是对肌肉组织的感染表达非常有限。

腺病毒：载体容量最大，可达6kb，感染3天后即可观察；免疫原性高，必须原位注射才可以；分子较大，会被体内防御系统识别进而清除，因此表达周期只有2-3周。一般目的基因比较大，试验周期短，才会选择此种方法。

腺相关病毒：（在体实验的最佳选择）腺相关病毒很小，易于扩散，具有均一性；这一特点也使得不易被免疫系统发现，免疫原性低，安全性高；能持续在体内表达3-6个月，具有长效性；可以选择特殊血清型AA V1/2/9感染，相对特异性强；可以直接静脉注射；也可以肌肉原位注射。主流杂志一致认可，可提高文章分值档次，大文章必备。缺点：片段容量小、表达到高峰所需的时间长。

3、AA V血清型选择

目前靶向肌肉的AA V载体血清型主要为AA V1、AA V2和AA V9。其中，AA V9的表达效率最高，并且更容易在肌肉中高表达。

需要注意的是，无论AA V1/2/9中的哪种血清型，都不能在肌肉组织特异性表达。除了肌肉外，AA V1还可能在肌肉、骨骼肌、神经组织表达；AA V2可以感染肝脏等；AA V9还可以在肌肉、中枢神经、肺、肝脏表达。

汉恒肌肉特异性AA V，通过AA V9优选肌肉特异性启动子，实现肌肉的高效基因转导：

①高感染表达率：汉恒强启动子载体AA V9，通过静脉注射，高效感染肌肉，

特异性上略差。

②高肌肉特异性AA V：汉恒经严密筛选，确定肌肉特意的MCK特异性启动子，高特异的表达于肌肉组织。肌肉中起始MCK正常转录的元件较多，因此在肌肉中相对表达量较其他部位高出很多。这里的表达是相对的，也就是说其他部位也可能会表达目的基因，但是跟肌肉的表达量相比，可以忽略不计。

4、注射方式：

对于肌肉来说，慢病毒跟腺病毒均不推荐。我们强烈建议使用AA V作为在体肌肉基因转导的工具。常见的注射方式有原位注射和尾静脉注射（带有特异性启动子）。

肌肉原位注射(图1)：直接注射是通过注射器或类似装置直接注入肌肉组织，可以在注射点附近高效表达，但缺点是病毒扩散十分有限，因此往往需要多点注射，一般每个点在10-15ul。通常CMV、CAG等启动子在肌肉组织中具有较高的表达效率，如果要实现肌肉组织的特异性表达，可以采用定点的递送方式达到。

图1 小鼠肌肉原位注射效果图

选用8周龄C57小鼠原位多点注射骨骼肌。(A). AA V9-LUC感染4周后活体成像。病毒滴度：1*1012v.g/ml，10ul/点，4个点。(B). AA V9-GFP，感染4周后冰冻切片荧光显微镜检测。病毒滴度：1*1012v.g/ml，10ul/点，4个点。

尾静脉注射（图2）：从动物尾部的静脉注射病毒，以输送到全身各处肌肉。这种方式病毒表达较均匀，但是大部分会被其他脏器组织吸收，导致靶向肌肉的病毒较少。因此这种注射方式需要带有肌肉特异性的MCK启动子来驱动目的基因表达。

图2. 通过尾静脉注射感染小鼠腓肠肌示意图。a图是AA V介导的、用MCK特异性启动子驱动外源基因表达的效果图；b图是mdx小鼠的对照（Wang, B., et al. 2000, PNAS）。