基因工程技术及应用

G
GATCC
CCTAG
G
G
GATCC
切
CCTAG
G
分
接
转
筛 表
2.2 基因工程操作步骤和相应技术
基因工程的操作包含以下步骤： • 获得目的基因 • 构造重组 DNA 分子 • 转化或转染 • 表达 • 蛋白质产物的分离纯化
2.2.1目的基因的获得
到哪里去找目的基因？一般来说，人的基因， 要从人体的组织细胞中去找；小鼠的基因要从 小鼠的组织细胞中去找。 目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行： ①直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生 物基因的分离，较少采用。 ②人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序， 利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工 合成。适应于编码小分子多肽的基因。
隆所用的技术方法及相关工作称基因工程，也称重 组DNA技术.或重组DNA工艺学。
定义：基因工程是指将外源目的基因（一段 DNA片段）组合到载体DNA分子（质粒， 噬菌体或病毒等）中去，再使它转染进入 受体细胞（亦称寄主细胞），在受体细胞 中外源基因得以增殖和表达，从而得到期 望的由这个外源基因所编码的目的蛋白质。
重组DNA的筛选和鉴定
• 由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需 要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。可 采用以下方法进行：
• 根据重组体的表型进行筛选： 对于带有抗药基因的 质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。如 pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将 目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失 活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在 含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素 的培养基上不能生长的细菌即为带重组质粒的细菌。
其原理是依据DNA半保留复制机理、DNA在不同 温度下变性、复性的特性，人为控制温度——使其 高温变性、低温复性、适温延伸，循环多次后，可使 目的基因得到扩增。
以待扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板 DNA正链3末端和负链3末端互补配对的寡核苷酸片 段为引物，在DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷 三磷酸为原料按照半保留复制的机制沿着模板链延伸 合成新的DNA双链，这一过程（变性、退火、延伸） 重复进行，即可使目的DNA片段得到扩增。
2.基因工程的基本程序：
2.1 基因工程的主要操作流程可以简述如下： 分、切、接、转、筛、表
分：目的基因的获取、载体的选择 切：限制性内切酶切取基因片段和载体接口 接：用连接酶将目的基因和载体连接成重组体 转：将重组子导入到受体细胞 筛：采用适当的方法筛选出含有目的基因的阳性克隆 表：目的基因在受迹法。样品或基因内切酶切开 DNA电泳
印迹转移
印迹法
胶片显影
放射性探针A 片断混合物通过凝胶电泳分离。 ③电泳后，通过印迹技术转移到酯酰纤维薄膜 上，以便操作。 ④用已知放射标记的小片断DNA 作为探针， 互补结合寻找的目的基因片断。 ⑤胶片经放射自显影，识别分离标记片段—— 目的基因。
位
+ CCTAG
G
G
GATCC
点
CCTAG
G
T4 DNA连接酶
连 GGATCC
接
CCTAGG GGATCC
CCTAGG
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
15ºC
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
目的基因自连
重组体
载体自连
载体：单独的DNA片段不能完成自我复制， 必须将其连接到特定的、具有自我复制能力 的DNA分子上，这种DNA分子即为基因克 隆载体 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质 粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三 大类。
2.2.5转化/转染—表达—蛋白质分离
把构造好的重组 DNA 分子送进寄主细胞， 亦需要适当的技术方法。若以质粒作载体将质 粒导入受体细菌，通常称转化；若质粒、病毒 作为载体将重组子导入 动/植 物细胞，或以噬 菌体作为载体将重组子导入细菌细胞通常称转 染。
受体细胞必须处在感受态才能接受外源性 DNA。用CaCl2处理，增加细菌细胞壁的通透 性。
• 限制酶目前已经发现3600多种，所识别的顺序往 往为4-8个碱基对，且有回文结构。
载体和目的基因的重组 • 将带有切口的载体与所获得的目的基因连接
起来，得到重新组合后的DNA分子。
• 当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进 行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。 如将载体与目的基因混合在一起，二者即可 通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连 接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。 较少 的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。
印迹法的关键是“分子杂交”，利用碱 基配对的原则，用一段小的已知的 DNA 片 断去寻找（“钓”）大的目的基因片断。
探针 DNA 片断从何而来？ 根据目的蛋白的氨基酸序列，只要其中 N －端 15－20 个氨基酸序列，按三联密码转 为 40-60 核苷酸序列，人工合成，即可作为 探针 DNA 片断。
⑤利用PCR合成 如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应(pol 但此法主要用于目的基因的扩增
2.2.2 目的基因的扩增 用上面的方法“钓”出的目的基因，数 量极少，所以，接下来必须经过扩增， 亦称为基因克隆。获得相当数量的目的 基因后，才能继续下一步操作。
克隆（clone)：无性增殖过程都称为克隆。
质粒：双链环状小分子DNA，通常带有细菌 的抗药基因，适于做小片断基因的载体。 最早使用的质粒
DNA是人工构建的 pBR322，该质粒分 子大小为4.3kb，带 有抗四环素和抗氨 苄青霉素基因，含 EcoRⅠ，BamHⅠ， HindⅢ等单一的限 制酶切点。
噬菌体：线状双链DNA，可通过转染方式将 其DNA送入细菌体内进行增殖。可接受15 kb～20 kb的外源DNA片段，适于做大片断 基因的载体。
第7讲
基因工程技术和应用
1、基因工程技术概述
基因工程是生物技术工程的核心部分。
生物工程技术: 基因工程、蛋白质工程、微生物
工程、酶工程、细胞工程等工程技术
基因(gene)：是生物体传递遗传信息和表达遗传信
息的基本单位。目前认为它是合成有功能的蛋白质 或RNA所必需的全部核苷酸序列
基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克
用核酸杂交法鉴定：为了进一步鉴定重组体中的目的
Southern印迹
重组 DNA 分子进入寄主细胞后， 其中的目的基因能否表达，表达效率高 低，还有很大差别。表达通常是指目的 基因编码的蛋白质合成。
基因工程的最后一步，是把所获得的 蛋白质分离纯化，得到蛋白质产品。
3.基因工程的应用
基因工程技术已经在医学、工业、农业 等各个领域得到了广泛的应用。 2.1 在医学上的应用 基因工程药物：基因工程被用于大量生产过 去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质－肽 类药物。 基因工程用于疫苗生产：基因工程疫苗不含 病原物遗传信息，无感染性危险。 基因工程用于基因治疗
根据标志互补进行筛选： 当宿主细胞存在某种 基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法 筛选重组体。即在载体DNA分子中插入相应 的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因 的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。
根据DNA限制酶谱进行分析： 经过粗筛后的 含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进 一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取 其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶 切，再将其与不含目的基因的载体一起进行 电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的 电泳带即证明重组体中带有目的基因。
PCR 反应分三步完成： 第一步:90℃高温下，使混合物的DNA 片断因 变性而成单链。 第二步:50℃下，引物 DNA结合在适于配对的 DNA片断上。 第三步:70℃下，由合成酶(DNA高温聚合酶， Taq酶)催化，从引物开始合成目的基因DNA。
完成三个步骤为一次循环，约需6－10 分 钟。循环一次，目的基因扩增一倍。经过 20 次循环，即可扩增 106 倍，总共只需几 个小时。
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
GCATGC+
GAC CTG
平端切口
BamHⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+GATCGC 粘端切口
同 一
GGATCC CCTAGG
Bam HⅠ切割反应
限
制
G CCTAG
GATCC G
酶
目的基因用 Bam HⅠ切割
载体DNA用Bam HⅠ切割
切
G
GATCC
酶。 载体和目的基因的切断
• 通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶。
• 由限制酶切断后的末端可形成平端、3‘-突出粘性 末端和5’-突出粘性末端(cohesive end)三种情况。
• 相同限制性内切酶切割目的基因和载体DNA形成 粘性末端互补，便于连接。
③从mRNA合成cDNA： 采用一定的方法钓取特定基因DNA用适当的限制酶切断 后，与载体DNA重组，再全部分别转化宿主细胞y)。
方法：将某种细胞的全部mRNA通过逆转录合成 cDNA，然后转化宿主细有 组织细胞特异性。
生物分子， 细胞， 生物个体
——克隆
PCR技术——把寻找目的基因和扩增目
的基因两步操作并成一步
PCR 法，又称多聚酶链式反应，是上世纪 末开发出来的基因工程新技术，它的最大优 点是把目的基因的寻找和扩增，放在一个步 骤里完成。
PCR(polymerase chain reaction) ——聚合酶链式反应
分子生物学上的三大技术
• 限制性内切酶及连接酶的发现和应用 • 基因工程载体（质粒、病毒、染色体） • 逆转录酶的发现和利用
限制性内切酶（restriction enzyme）是细菌体内 含有的一类能特异识别双链DNA分子的特定序列， 并对其进行切割的核酸内切酶。共有三类，其中第 二类因其有固定的切割位点，只有酶限制性无修饰 性，不需要ATP，实用性大，是基因工程常用工具酶。 如： EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ
PCR基本原理
模板DNA— 5 目的基因
5
引物A
5
5 引物B
第一次循环
5 5
5 5
第二次循环
5
5
5
5
5
5 5
5
第三次循环
5
5
5
5
5
5
5 5
5
5
5
5
5
5
5
5
一次循环大约需要6～10min. 25～30 次循环后， 模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。
2.2.3 载体
载体：基因工程中常用的载体(vector)主要包 括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒 (virus)三大类。 这些载体均需经人工构建，除去致病基因， 并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的 标志基因、单一的限制酶切点等。
常用的为人工构建的λ噬菌体载体。噬菌体 两端的片段对于其包装是必需的，因而应 予保留；而其中间部分则可进行改造或置 换，使之具有某种单一的限制酶切点。
病毒： 常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送
入哺乳动物细胞中进行增殖。目前应用相对较少。
把2.目2.4的重基组因“DN装A”到分载子体的中构去造，需要几种工具
目的：
① 分离获得某一有用的基因或DNA
② 获得有用的基因表达产物（蛋白质）
基因工程的理论和技术基础
基因工程技术的诞生以分子生物学领域 中的三大理论和三大技术为基础
基因工程的理论基础
• 20世纪40年代发现生物的遗传物质是DNA • 20世纪50年代揭示了DNA分子的双螺旋结
构和半保留复制机制 • 20世纪70年代确定了遗传信息的传递方式
转基因植物亦已在大田中广为播种。
3.2 基因工程在工业中的应用 生产奶酪的凝乳酶传统上来自哺乳小牛的胃。
现在可以通过基因工程办法，用酵母生产凝 乳酶，大量用于奶酪制造。
哺乳小牛
凝乳酶基因
胃ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
转入啤酒酵母
凝乳酶
凝乳酶
制造奶酪
2.3 转基因动物和植物 转基因动物首先在小鼠获得成功。现
在转基因动物技术已用于牛、羊，使得 从 牛/羊 奶中可以生产蛋白质药物。称 为“乳腺反应器”工程。