2017年主管检验技师考试临床免疫学和免疫检验讲义第七章放射免疫分析

第七章放射免疫分析

第一节放射免疫技术

一、优点

灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点。

用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析。

二、基本类型及原理

（一）放射免疫分析（RIA）是以放射性核素标记的抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体为基本原理来测定待检样品中抗原量的一种分析法。

（二）免疫放射分析（IRMA）是用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析法。

三、常用的放射性核素

125I、131I、3H、14C等，使用最广泛的是125I。

四、放射性标记物制备及鉴定

（一）原理：以放射性碘原子通过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。因此，凡蛋白质、肽类等化合物在结构中含有上述基团者，均可用125Ⅰ直接标记，而对那些不含上述基团的甾体激素或药物分子，则必须在分子结构上连接相应基团才能用于放射性碘标记。

（二）标记及类型

1.直接标记法：肽类、蛋白质和酶的碘化标记，其特点是标记方法操作简便，易得到比放射性较高的标记物。常用方法为：①氯胺T(ch-T)法；②乳过氧化物酶标记法。

2.间接标记法：也称联接标记法，是最常用的间接碘标记方法。该法主要用于甾体类化合物、环核苷酸、前列腺素等缺乏碘标记基团的小分子化合物的标记。

（三）标记物的纯化：125Ⅰ标记物反应后，标记物需进行分离纯化以去除游离125Ⅰ和其他杂质。纯化标记物的方法有利用分子筛机制的凝胶过滤法、利用游离125Ⅰ与标记物分子极性差异进行吸附解离的离子交换层析法、按分子所带电荷和直径不同在电场作用下分子迁移速率不同进行分离纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）以及高效液相色谱法。

（四）标记物的鉴定

1.放射化学纯度：是指单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率，一般要求大于95%。该项参数还是观察在贮存期内标记物脱碘程度的重要指标。

2.免疫活性

3.比放射性

五、方法学评价

为增强结果的可比性，需对RIA方法学进行评价。除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标：

（一）可靠性：又称健全性，是评价被测物与标准品的免疫活性是否相同的指标。借助标准曲线与样品稀释曲线的平行性分析来判断方法的可靠性。平行性好者可靠。

（二）剂量-反应曲线：标记免疫实验是通过已知浓度的标准品和相应的反应参数绘制成剂量-反应曲线，待测物定量是通过计算其反应参数在剂量-反应曲线上对应的标准品浓度值而确定。

（三）高剂量钩状效应：高剂量钩状效应(HOOK效应)是指当标本中被测物浓度超过线性范围上限时，所得结果反而降低或呈阴性的现象。

第二节放射免疫分析

放射免疫分析（RIA）是以放射性核素作示踪剂的标记免疫分析方法，它具有高度灵敏性、特异性和精确性等特点，特别适用于激素、多肽等含量微少物质的超微量分析。

一、基本原理

经典RIA是采用标记抗原和非标记抗原竞争性结合有限量特异性抗体的反应。

二、实验方法及测定

（一）抗原抗体反应：将未标记抗原（标准品和待测样品）、标记抗原和特异性抗体加入反应试管中，在一定条件（温度、时间及介质pH）下进行竞争抑制反应。

（二）分离结合与游离标记物：RIA反应平衡后，标记抗原与试剂抗体形成免疫复合物（B）。由于其含量极少，不能自行沉淀，因此需加入适当的沉淀剂才能将其彻底沉淀，然后经离心使其与游离的标记抗原（F）分离。某些小分子抗原，也可采用吸附法分离B与F。

理想的分离方法应分离彻底、迅速；分离试剂和过程不影响反应平衡，而且效果不受反应介质因素的影响；操作应简单、重复性好以及经济。目前RIA常用的分离方法有以下几种：

1.第二抗体沉淀法：其原理是用RIA反应中的试剂抗体(一抗)如豚鼠的IgG免疫另一种动物(如羊），制得羊抗豚鼠IgG血清(二抗）。RIA反应结束时，加入二抗，使其形成抗原、一抗-二抗的双抗体复合物；但因一抗含量甚微，此复合物也少,不易离心分离，一般还需加入一定量的与一抗同种动物的血清或IgG，使其与二抗形成较大量的可见沉淀物，与双抗体复合物共沉淀；离心后，即可有效地分离B和F。也可将二抗与某些颗粒固相物连接，制成固相二抗，分离B、F效果也好。

2.聚乙二醇（PEG）沉淀法：PEG能非特异地沉淀抗原抗体复合物等大分子蛋白质，而不沉淀小分子抗原，因此PEG被广泛用于RIA实验作沉淀剂。其优点是沉淀完全、经济方便，但非特异性沉淀较多，且当温度髙于30℃时，沉淀物易复溶。

3.PR试剂法先将二抗与PEG按一定比例混合成悬液后进行试验。此法保留了二者的优点，节省了二者的用量，且分离迅速，简便。先将二抗与PEG按一定比例混合成悬液后进行试验。此法保留了二者的优点，节省了二者的用量，且分离迅速，简便。

4.活性炭吸附法：活性炭可吸附小分子游离抗原或半抗原，而大分子蛋白（如抗体和免疫复合物)则留在溶液中。抗原抗体反应后，加入活性炭颗粒，使游离的标记抗原(F)吸附到颗粒上，再离心使颗粒沉淀，上清液中含有的标记抗原抗体复合物(B)供测定。该法主要用于测定小分子抗原或药物的RIA。

（三）放射性测量及数据处理

分离B、F后，既可对标记抗原抗体复合物（B）进行放射性测量，也可根据RIA实验方法及目的，测定游离标记抗原（F）。绘制标准曲线（剂量-反应曲线），样品管以其测量或计算的反应参数，通过标准曲线即可查出相应的待检抗原浓度。

第三节免疫放射分析

免疫放射分析（IRMA）是以过量125I标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应，用固相免疫吸附剂对B或F进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA，操作程序较RIA简单。

一、基本原理

（一）单位点IRMA：先利用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原-抗体复合物，反应平衡后，再用固相抗原结合反应液中剩余的未结合标记抗体并将其分离，测定上清液的放射量。