化学发光免疫分析法-自己整理

化学发光免疫分析法（CLIA）
A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法：
（竞争法：用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体，待检抗原与检测信号成反比）
、原理：本实验采用竞争法，酶标抗原与标准品抗原竞争抗体，标准品抗原浓度越大，结合到抗体上的酶标抗原越少，RLU越小，B/B o值越小。

例：A为一种抗原小分子，有免疫反应性。

实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析，使待测A、辣根过氧化物酶标记的A（A-HRP在均相体系中与异硫氰酸荧光素（FITQ标记的兔抗A抗体（FITC-A抗体）发生竞争性免疫反应，再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒，反应生成物结合在磁微粒上，在磁场经分离、洗涤后加发光底物，
用冷光分析仪检测发光强度（RLU，测定尿液中A的含量
、仪器:
Flash ' n glow LB955管全自动进样冷光分析仪（Berthold公司）; 高速离心机（Beckman公司）,转速13000 r/min
磁性分离器（北京科美生物技术有限公司定制，磁场强度2800高斯） XW80旋涡混合器（上海精科实业有限公司）
试管12 X 60 mm®江拱东医用塑料厂）磁性微粒子（磁性分离剂,Adaltis公司）
三、试剂
1、A标准品
2、A单克隆抗体
•0——AFBi-BSA^HRP *：F!TC H AFB I +^4}
抗FITCE
FITC庐合別比
FITCr^t I-
-r i詩玩FITC AFB1 FrrOAFBt^JMI 时fTC旳舸更片单丸
垮序汗士体-F：障羊舍和料TJ5H笛箭
♦—厲FR1 AF61^
■ —FITC
(- 歼ITC
一餅
3、A-BSA吉合物
4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子（5mg/mL）
5、F ITC标记的A单克隆抗体
6 HRP标记的A
7、P BST 洗涤液L PBS,含% Tween-20）
8、分析缓冲液mol/L的PBS缓冲溶液,pH ,含%BSA %的水解明胶、％的Procli n-300）
9、发光底物液（鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液）
实验用水为二次蒸馏水
四、试剂处理
1、用分析缓冲液为稀释液，梯度稀释标准品；
2、取A-BSA-HR溶液，以分析缓冲液为稀释液，梯度稀释,配制1:1000、1:2000、1:5000的A-BSA-HRP溶液,4 C保存.FITC-A单克隆抗体溶液的配制：取FITC-A 单克隆抗体溶液，以分析缓冲液为稀释液，梯度稀释，配制1:1000、1:2000、
1:5000、1:10000、1:12000的FITC-A单克隆抗体溶液，4 C保存。

（具体分析）五、数据处理
通过测量标准品和样品溶液的发光强度（RLU）使用Flash ' n glow LB9发光分析
仪自带软件中的数据处理程序对测得的数据进行处理•线性方程采用的是
logit（Y）-log（X）的线性回归数学模型,以logitY为纵坐标,logX为横坐标,其线性方程表达式为logit（Y） = a + blog（X）,线性方程中X为标准品（或待测样品）溶液的浓度,logit（Y） =ln （y/1-y）,y=B/B0式中,B为标准品（或待测样品）溶液的发光强度, B0为不加标准品（或待测样品）而加分析缓冲液的发光强度•根据标准品的浓度和发光强度值，经线性回归得标准曲线，代入样品的发光强度值得样品的浓度。

板式磁性微粒子化学发光免疫分析法（双抗体夹心法）：
原理：以磁性微粒子作为分离固相，96孔板为反应容器，辣根过氧化物酶（HRF）催化H2O2-liminol化学发光体系作为检测体系。

采用双抗体夹心法，在溶液中形成FITC抗体一抗原-HRP复合物，引入偶联FITC抗体的磁性微粒子，在反复施加磁场的作用下，通过洗涤将没有结合的游离蛋白与免疫复合物分离，以辣根过氧化物酶（HRP催化H2O2-liminol化学发光体系作为检测体系，实现对待测抗原的检测。

Magnetic Anti-FITC
图：！化学发光免疫分析的基本原理
仪器
BHP9504 微孔板化学发光分析仪（北京滨松光子技术有限公司, 北京）; 管式发光分析仪（Berthold 技术有限公司, 德国）;
DEM-III 型洗板机（北京拓普分析仪器有限公司, 北京）; 电热恒温水浴箱（北京长安科学仪器公司, 北京）;
XW-80A旋涡式震荡混合仪（上海精科实业有限公司,上海）；
白色不透光96-孔微孔板（英科新创科技有限公司, 厦门）; 磁分离器采用美国Promega 公司的Magnabot 96 磁分离装置. 试剂
A 标准品以及配对的A 单克隆抗体均购自Fitzgerald 公司（康科德, 美国）;
辣根过氧化物酶（HRP）异硫氰酸荧光素（FITC以及Tween 20购自Sigma-Aldrich 公司（圣路易斯, 美国）;
化学发光底物（鲁米诺和H2O2）来自美国的DPC公司；
牛血清蛋白（BSA购自德国的Merck公司；抗FITC抗体包被的磁颗粒悬浊液（粒径：卩m,浓度：5 mg/mL）购自意大利的Adaltis公司.
5、96孔微孔板先用300卩含1% （w/V）的BSA的磷酸缓冲液（PBS在4 C封闭12 h；整个实验过程中的冲洗液为浓度是mol/L 的磷酸盐缓冲液, 含%吐温-20
（V/V）.
6、正常混合人血清来自北京科美东雅生物技术有限公司, 所需血样来自于解放军301 医院（北京）门诊及住院病人.
7、样品标本无需特殊处理, 采用常规医用技术收集全血, 静置, 离心沉淀后, 吸取血清,分装,密封,-20 C保存备用.检测前,血清于室温平衡30 min后，轻微摇晃使其混匀.
四、实验方法
具体操作步骤为：先将25卩L A标准品（梯度浓度稀释）或待测血清，40卩L HRA抗体结合物和40卩L FIT-A抗体结合物加入到96孔板的微孔内；在37 C条件下温育70 min后，向体系中加入80卩L抗FITC抗体包被的磁颗粒悬液；再经过15 min 的孵育后, 用96 孔板专用磁分离器进行分离, 洗涤液清洗 3 次；最后加入90卩鲁米诺和H2O2化学发光底物，在室温下放置10 min后进行发光测量.
C、对比。