动物遗传学实验.

四、实验步骤
❖ PCR扩增
反应体积（20μl），在0.2ml Eppendorf中依次加样：
10×PCR buffer 2.0μl
MgCl2
1.6μl
dNTPs 上游引物 下游引物 DNA ddH2O rTaq
1.6μl 0.5μl（10μmol/L） 0.5μl（10μmol/L） 1.0μl 12.6μl 0.2μl
五、作业
❖ 写出实验的过程并描述你所观察到的结果
实验三 限制性片段长度多态性
一 实验目的
❖ 学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP） 遗传标记的基本原理和检测方法
二 实验原理
第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个 体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突 变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重 排等，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可 以通过PCR及琼脂糖凝胶电泳进行检测，从而可比 较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态 性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基 因定位以及生物进化和分类的研究。
三 实验原理
❖ 1933年，美国德州大学的Thoephilus painter 在某些昆虫细胞中发现了巨大染色体
❖ 双翅目昆虫（果蝇）幼虫期的唾液腺细胞很 大，其中的染色体称唾液腺染色体，比一般 的普通染色体的100－150倍，又称巨大染色 体。
❖ 在幼Байду номын сангаас发育过程中，这些细胞停止有丝分裂， 但唾液腺染色体仍然进行复制，产生多线染 色体。
❖ 多线染色体经染色后，出现深浅不一、宽窄 不同的带，这些带的数目和位置是恒定的， 代表着果蝇等昆虫的种的特征。如果染色体 缺失、重复、到位、易位等，很容易在唾腺 染色体上识别出来。
四、实验材料和用品
❖ 实验材料
黑腹果蝇的三龄幼虫
❖ 实验用品
显微镜、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、 滤纸。
E－生理盐水、 1％醋酸洋红。
六： 作业
❖ 实验报告 ❖ 分组值日 ❖ 显微镜放回原位
实验二 PCR扩增和琼脂糖电泳检测
一、实验目的
❖ 学习和掌握PCR扩增及琼脂糖电泳的基本原 理和方法。
二、实验原理
❖ 多聚酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。 在待扩增的DNA片段两侧设计寡核苷酸引物， 经变性（94℃）、退火（45~68℃）和延伸 （72℃）若干个循环后，DNA扩增2n倍。
四、实验步骤
❖ PCR扩增
反应条件：
94℃ 3min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 40s（循 环28次），72℃ 10min在PCR扩增仪上进行扩增。
四、实验步骤
❖ 琼脂糖凝胶电泳
配制1.5%琼脂糖凝胶，取5μl PCR扩增产 物+1μl 上样缓冲液电泳。DNA带负电荷，电 泳时DNA从负极向正极泳动。待泳动至凝胶 的1/2~2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下 观察。
四 实验步骤
❖ Hind Ⅲ 限制性内切酶酶切
反应体积（10μl），在0.2ml Eppendorf中依次加样：
10xbuffer
1.0 μL
ddH2O
5.5 μL
Hind Ⅲ PCR产物
0.5 μL 3.0 μL
37℃水浴消化2h，消化产物全部用于琼脂糖检测。
四 实验步骤
❖ 琼脂糖凝胶电泳
配制1.5%琼脂糖凝胶，取10μl 酶切产物 +1μl 上样缓冲液,180V恒压电泳。DNA带负 电荷，电泳时DNA从负极向正极泳动。待泳 动至凝胶的1/2~2/3位置时，停止电泳，紫外 检测仪下观察。
五、实验步骤
❖ 染色10 分钟，盖上盖玻片，用滤纸轻压一下 吸去多余的染色液后放在桌子上，用大拇指 用力，并横向揉几次（勿使盖玻片移动）。
❖ 显微镜观察，先在低倍镜下观察，找到分散 好的染色体图像，再高倍镜观察，画图。
❖载玻片滴生理盐水→放幼虫→用解 剖针将头部和身体拉开→找到唾液 腺并将其剥离干净→转移到有一滴 醋酸洋红的载玻片上→10min→盖盖 玻片→压片→观察
❖ 所使用的酶为耐热的DNA聚合酶（Taq酶）。 琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过α（1→3）和 β（1→4）糖苷键交替构成的线状聚合物
❖ 根据浓度的不同，琼脂糖凝胶可以构成一个 直径从50nm到略大于200nm的三维筛孔的通 道。将DNA加到凝胶的负极，在电场的作用 下，将不同大小的片段分开
三、仪器、材料与试剂
《动物遗传学》实验
山东农业大学动科学院 主讲：姜运良
实验一 果蝇唾液腺细胞的染色体
一 实验目的
❖ 练习果蝇唾液腺的分离方法 ❖ 掌握唾液腺染色体的制片技术 ❖ 观察唾液腺染色体的特点
二 遗传物质发现的历史
❖ 19世纪60年代——孟德尔定律（遗传单位） ❖ 19世纪80年代——染色体 ❖ 1903年——同源染色体 ❖ 1909－1911年——交换 or 遗传重组 ❖ 1911年——染色体图谱 ❖ 1944－1952年——DNA（遗传物质） ❖ 1953年——DNA双螺旋
❖ 仪器
PCR热循环仪 琼脂糖凝胶电泳及检测系统
❖ 材料与试剂
鸡基因组DNA dNTPs（10mmol/L） 上下游引物（浓度10μmol/L） rTaq酶（5U/μL）
DL2000 DNA Marker MgCl2（25mM） 10×PCR缓冲液 灭菌双蒸水 1.5%琼脂糖（含EB，注意致癌） 电泳缓冲液，上样缓冲液。
三 仪器、材料与试剂
❖ 仪器： 电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检
测系统
❖ 材料与试剂：Hind Ⅲ 限制性内切酶，10×M
Buffer，待分析的PCR产物，DL2000 DNA Marker，6×Loading Buffer,灭菌双蒸水,1.5% 琼脂糖（注意：含溴化乙锭EB，致癌，请带手 套操作），电泳缓冲液，上样缓冲液。
五、实验步骤
❖ 载玻片置于显微镜下，上面滴加一滴生理盐 水，放上果蝇幼虫，两手各拿一枚解剖针， 左手解剖针按住幼虫的后端1/3, 右手解剖针 按住头部用力后拉，把头部从身体拉出，唾 液腺随之而出。（一对双叉形透明的囊状腺 体）。
❖ 除去幼虫其他组织部分，把唾液腺周围的脂 肪剥离干净，然后将唾液腺移到干净的滴有 醋酸洋红的载玻片上。