胚胎干细胞的研究与应用毕业论文正文

前言

胚胎干细胞(Embryonic stem cells ，ESCs ) 是胚胎源性多能干细胞．是从早期胚胎细胞团（inner cell mass，ICM)或着床后胚原始生殖细胞(Primor- dial germ ceils，PGCs )分离和克隆出来的一种具有无限增殖能力和全向分化能力的干细胞[1]。这两类细胞均可分化为包括神经细胞、造血干细胞、心肌细胞等在的各种细胞[2]。ESCs的发育全能性备受科学界的关注，而它所具有的广泛应用价值，已经成为当今国外生命科学研究的热点。

第一章 ESCs 研究中的相关知识

1．1 胚胎干细胞

1981年英国剑桥大学Evans和Kaufman首次对延迟着床的小鼠囊胚进行体外培养,首次分离得到小鼠ESCs。此后，人们又相继用不同的方法从猪、牛、兔、羊、猴等哺乳动物分离得到 ESCs。迟至1998年，美国威斯康辛大学的生物学家 James Thomson及其同事才首次分离、建成了第一个人的胚胎干细胞系[3]。这一成果给移植治疗、药物发现及筛选等等带来深远的影响，打开了在体外培养更多类型的可供移植治疗的人体细胞、组织和器官的大门。

1．2 胚胎生殖细胞 (Embryonic germ cells，EGCs)

EGCs是来自于早期胎儿生殖嵴的PGCs，是早期胚胎多能干细胞中的一种，具有自我更新和无限增殖的能力，能分化成代表三个胚层组织细胞能力的干细胞。Matsui等(1992 )和Res- nick等(1992)体外长期培养小鼠PGCs，建立了小鼠PGCs系,发现在适宜条件下,其在形态上和发育上类似于 ESCs，称为EGCst[4]。1998年，美国学者Shamb- lott等首先从受精后5—9周的人胚胎生殖嵴分离，培养并建立了EGCs系。

1．3 原始生殖细胞

PGCs是生殖谱系区别于体细胞的最初形式，是哺乳动物生殖细胞的祖细胞，早在1980年以前，Jeon和Brinster就分别对小鼠的PGCs的形态结构和能量代进行了研究；1992年，Matsui 等和Resniek等以分离小鼠胎儿的PGCs为材料,培养传代获得ESCs.从而首次较为全面地证实PGCs同样可以作为ESCs分离克隆的原材料[5]。

第二章 ESCs的来源

2.1 传统方法

从发育良好的囊胚中分离细胞群细胞或从5-9周的胚胎生殖腺中分离胚胎干细胞。培养条件：需要特殊的培养液、饲养细胞（人或胚鼠的成纤维细胞）、需要加入白雪病抑制因子抑制分化。1981年美国科学家Evans和Kaufman从小鼠胚胎分离出胚胎干细胞病成功建立，从此开辟了哺乳动物胚胎干细胞研究的新纪元。1990年Thomsn和Gearhrt利用细胞团和原始生殖细胞分别建立了人的胚胎干细胞系，这一结果的宣布将胚胎干细胞的研究又解开了新的一页！国在胚胎干细胞方面的综合性研究起步晚（1989年），但发展迅速。在基础研究方面，尚克刚、赖学良等已先后建立了小鼠和兔细胞系，盛慧珍研究小组在国际上首次构建了人-兔核移植重构胚。在研究方面，著名胚胎工程专家窦忠英的科研小组已第6次从人类胚胎干细胞中分化诱导得到心脏跳动样细胞团。中国军事医学科学院发现了“人胚胎干细胞素”，用于临床多种疾病的治疗取得了明显效果！

2.2 体细胞核移植

通过显微操作和细胞融合技术，见单细胞核体（卵裂球或体细胞的核）一如去核的受体（卵母细胞或受精卵）胞质构成重组胚，通过对重组胚的激活、培养得到动物胚胎干细胞。Willmut 等从一只六岁妊娠母羊乳腺中采取细胞，经培养传代和血清饥饿法处理后，通过核移植得到277枚融合胚，再经体培养后有29枚发育到囊胚，移植给13只受体母羊，其中有一只妊娠并最终产下了一只活羔，从而诞生了世界首例成年体细胞核移植后代。自从利用分化的成年乳腺细胞的大第一只体细胞克隆绵羊多利，其它物种的克隆也取得了很大的进展。体细胞克隆牛、山羊、鼠、猪和兔相继获得成功。在目前的克隆实验中，不同物种间克隆的效率略有区别，但总效率不高！

2.3 iPS细胞

iPS细胞首先是由Takahashi和Yamanaka在2006年建立的。他们利用叛转录病毒载体在小鼠成纤维细胞中导入了4个与多能型有关的基因—Oct4、Sox2、c-myc、Kif4。接着，利用里一个多能性标志分子Fbx15的表达对转染后的细胞进行了筛选，最终得到了具有胚胎干细胞某些特征的多能性干细胞，并命名“诱导产生的多能性干细胞”。一年后，3家实验室各自的研究证实了该结果的可靠性，并且提高了生产的iPS细胞的质量。不久，另外两项研究相继报道了利用形态学作为筛选标准来建立iPS细胞的方法，这一方法在建立人类iPSxde 研究中具有潜在的优势。在新近研究中，Yamanaka等人用他们在小鼠中使用过的4种银子实现了人

类皮肤成纤维细胞的重编程；而Thomson实验室选用的是他们自己筛选出的4种银子Oct4,Sox2,Nanog和Lin28，其中Oct4和Sox2在Yamanaka的研究中也很关键。紧随其后，Yamanaka小组又在原有工作基础上取得重要突破；从4个转录因子中去掉了肿瘤相关因子C-Myc，使iPS细胞的产生更为安全。目前，已有研究将iPS细胞用于治疗镰刀型贫血症小鼠。在短短一年多的时间里，iPS细胞的建立方法有了明显的改善，并且成功的应用于人类细胞的研究和疾病模型动物的治疗，说明这一方法既有可操作性和稳定性，并且其安全性也在不断提高，因此这种方法对将来的医学研究有着巨大的价值！

第三章 ESCs的基本特征

3．1 形态学特性

各种动物的ESCs具有与早期胚胎细胞相似的形态学结构：细胞体积小，胞质胞浆少，细胞核大，有一个或多个核仁，胞质结构简单，散布着大量的核糖体和线粒体，核形正常，保留了双倍体性质。在体外培养的小鼠ESCs紧密堆积，呈集落状生长，细胞之间界限不清，集落边缘可见少量已分化的扁平上皮细胞或梭形成纤维细胞。不同动物胚胎干细胞直径有所不同。总的来说，ESCs具有与胚胎细胞相似的形态特征。

3．2 基本特征

3．2．1 多能性(Pluripotency)

ESCs的多能性是指ESCs具有分化出多种细胞组织的潜能，参与部分组织的形成。表明ESCs 发育多能性的检测方法很多，主要有：①形成类胚体：体外培养诱导分化实验，将ESCs在不含分化抑制物的培养基上培养。可形成胚样结构类胚体，类似于正常胚胎的囊胚期，随后可进行不同程度的分化产生多种分化细胞。②特定组织：将ESCs在含有特定添加物的培养基中培养，可定向分化形成特定组织。③嵌合体：通过显微注射或其它方式使ESCs与受体胚结合，嵌合后，嵌合体就会参与多种组织发育。

3．2．2可操作性

ESCs的可操作性，是指ESCs可进行遗传操作选择(如导入异源基因、基因重组)等生物学特性。在体外抑制分化培养时，ESCs不但可以增殖，而且可以被用来进行各种操作，而这一点是以ESCs的以下两方面特性为前提的：①在对ESCs进行各种操作的过程中，其仍能保持其扩增和发育的全能性和多能性。②用于移植时，不易产生免疫排斥反应。由于来源于着床前胚胎的 ESCs的某些细胞表面免疫相关蛋白(如MHC)还未来得及表达，用于移植时不易产生免疫排斥反应，因此使其成为移植治疗和细胞治疗的潜在资源[6]。