胚胎干细胞的研究与应用毕业论文正文

前言
胚胎干细胞(Embryonic stem cells ，ESCs ) 是胚胎源性多能干细胞．是从早期胚胎细胞团（inner cell mass，ICM)或着床后胚原始生殖细胞(Primor- dial germ ceils，PGCs )分离和克隆出来的一种具有无限增殖能力和全向分化能力的干细胞[1]。

这两类细胞均可分化为包括神经细胞、造血干细胞、心肌细胞等在的各种细胞[2]。

ESCs的发育全能性备受科学界的关注，而它所具有的广泛应用价值，已经成为当今国外生命科学研究的热点。

第一章 ESCs 研究中的相关知识
1．1 胚胎干细胞
1981年英国剑桥大学Evans和Kaufman首次对延迟着床的小鼠囊胚进行体外培养,首次分离得到小鼠ESCs。

此后，人们又相继用不同的方法从猪、牛、兔、羊、猴等哺乳动物分离得到 ESCs。

迟至1998年，美国威斯康辛大学的生物学家 James Thomson及其同事才首次分离、建成了第一个人的胚胎干细胞系[3]。

这一成果给移植治疗、药物发现及筛选等等带来深远的影响，打开了在体外培养更多类型的可供移植治疗的人体细胞、组织和器官的大门。

1．2 胚胎生殖细胞 (Embryonic germ cells，EGCs)
EGCs是来自于早期胎儿生殖嵴的PGCs，是早期胚胎多能干细胞中的一种，具有自我更新和无限增殖的能力，能分化成代表三个胚层组织细胞能力的干细胞。

Matsui等(1992 )和Res- nick等(1992)体外长期培养小鼠PGCs，建立了小鼠PGCs系,发现在适宜条件下,其在形态上和发育上类似于 ESCs，称为EGCst[4]。

1998年，美国学者Shamb- lott等首先从受精后5—9周的人胚胎生殖嵴分离，培养并建立了EGCs系。

1．3 原始生殖细胞
PGCs是生殖谱系区别于体细胞的最初形式，是哺乳动物生殖细胞的祖细胞，早在1980年以前，Jeon和Brinster就分别对小鼠的PGCs的形态结构和能量代进行了研究；1992年，Matsui 等和Resniek等以分离小鼠胎儿的PGCs为材料,培养传代获得ESCs.从而首次较为全面地证实PGCs同样可以作为ESCs分离克隆的原材料[5]。

第二章 ESCs的来源
2.1 传统方法
从发育良好的囊胚中分离细胞群细胞或从5-9周的胚胎生殖腺中分离胚胎干细胞。

培养条件：需要特殊的培养液、饲养细胞（人或胚鼠的成纤维细胞）、需要加入白雪病抑制因子抑制分化。

1981年美国科学家Evans和Kaufman从小鼠胚胎分离出胚胎干细胞病成功建立，从此开辟了哺乳动物胚胎干细胞研究的新纪元。

1990年Thomsn和Gearhrt利用细胞团和原始生殖细胞分别建立了人的胚胎干细胞系，这一结果的宣布将胚胎干细胞的研究又解开了新的一页！国在胚胎干细胞方面的综合性研究起步晚（1989年），但发展迅速。

在基础研究方面，尚克刚、赖学良等已先后建立了小鼠和兔细胞系，盛慧珍研究小组在国际上首次构建了人-兔核移植重构胚。

在研究方面，著名胚胎工程专家窦忠英的科研小组已第6次从人类胚胎干细胞中分化诱导得到心脏跳动样细胞团。

中国军事医学科学院发现了“人胚胎干细胞素”，用于临床多种疾病的治疗取得了明显效果！
2.2 体细胞核移植
通过显微操作和细胞融合技术，见单细胞核体（卵裂球或体细胞的核）一如去核的受体（卵母细胞或受精卵）胞质构成重组胚，通过对重组胚的激活、培养得到动物胚胎干细胞。

Willmut 等从一只六岁妊娠母羊乳腺中采取细胞，经培养传代和血清饥饿法处理后，通过核移植得到277枚融合胚，再经体培养后有29枚发育到囊胚，移植给13只受体母羊，其中有一只妊娠并最终产下了一只活羔，从而诞生了世界首例成年体细胞核移植后代。

自从利用分化的成年乳腺细胞的大第一只体细胞克隆绵羊多利，其它物种的克隆也取得了很大的进展。

体细胞克隆牛、山羊、鼠、猪和兔相继获得成功。

在目前的克隆实验中，不同物种间克隆的效率略有区别，但总效率不高！
2.3 iPS细胞
iPS细胞首先是由Takahashi和Yamanaka在2006年建立的。

他们利用叛转录病毒载体在小鼠成纤维细胞中导入了4个与多能型有关的基因—Oct4、Sox2、c-myc、Kif4。

接着，利用里一个多能性标志分子Fbx15的表达对转染后的细胞进行了筛选，最终得到了具有胚胎干细胞某些特征的多能性干细胞，并命名“诱导产生的多能性干细胞”。

一年后，3家实验室各自的研究证实了该结果的可靠性，并且提高了生产的iPS细胞的质量。

不久，另外两项研究相继报道了利用形态学作为筛选标准来建立iPS细胞的方法，这一方法在建立人类iPSxde 研究中具有潜在的优势。

在新近研究中，Yamanaka等人用他们在小鼠中使用过的4种银子实现了人
类皮肤成纤维细胞的重编程；而Thomson实验室选用的是他们自己筛选出的4种银子Oct4,Sox2,Nanog和Lin28，其中Oct4和Sox2在Yamanaka的研究中也很关键。

紧随其后，Yamanaka小组又在原有工作基础上取得重要突破；从4个转录因子中去掉了肿瘤相关因子C-Myc，使iPS细胞的产生更为安全。

目前，已有研究将iPS细胞用于治疗镰刀型贫血症小鼠。

在短短一年多的时间里，iPS细胞的建立方法有了明显的改善，并且成功的应用于人类细胞的研究和疾病模型动物的治疗，说明这一方法既有可操作性和稳定性，并且其安全性也在不断提高，因此这种方法对将来的医学研究有着巨大的价值！
第三章 ESCs的基本特征
3．1 形态学特性
各种动物的ESCs具有与早期胚胎细胞相似的形态学结构：细胞体积小，胞质胞浆少，细胞核大，有一个或多个核仁，胞质结构简单，散布着大量的核糖体和线粒体，核形正常，保留了双倍体性质。

在体外培养的小鼠ESCs紧密堆积，呈集落状生长，细胞之间界限不清，集落边缘可见少量已分化的扁平上皮细胞或梭形成纤维细胞。

不同动物胚胎干细胞直径有所不同。

总的来说，ESCs具有与胚胎细胞相似的形态特征。

3．2 基本特征
3．2．1 多能性(Pluripotency)
ESCs的多能性是指ESCs具有分化出多种细胞组织的潜能，参与部分组织的形成。

表明ESCs 发育多能性的检测方法很多，主要有：①形成类胚体：体外培养诱导分化实验，将ESCs在不含分化抑制物的培养基上培养。

可形成胚样结构类胚体，类似于正常胚胎的囊胚期，随后可进行不同程度的分化产生多种分化细胞。

②特定组织：将ESCs在含有特定添加物的培养基中培养，可定向分化形成特定组织。

③嵌合体：通过显微注射或其它方式使ESCs与受体胚结合，嵌合后，嵌合体就会参与多种组织发育。

3．2．2可操作性
ESCs的可操作性，是指ESCs可进行遗传操作选择(如导入异源基因、基因重组)等生物学特性。

在体外抑制分化培养时，ESCs不但可以增殖，而且可以被用来进行各种操作，而这一点是以ESCs的以下两方面特性为前提的：①在对ESCs进行各种操作的过程中，其仍能保持其扩增和发育的全能性和多能性。

②用于移植时，不易产生免疫排斥反应。

由于来源于着床前胚胎的 ESCs的某些细胞表面免疫相关蛋白(如MHC)还未来得及表达，用于移植时不易产生免疫排斥反应，因此使其成为移植治疗和细胞治疗的潜在资源[6]。

3．2．3全能性(totipotenty)
ESCs的全能性是指其在解除分化抑制的条件下，能发育为构成机体不同细胞类型中包括生殖腺在的任何一种细胞的潜力。

ESCs具有很强的分化能力，可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织和器官。

细胞全能性的实质是细胞基因组中决定蛋白质编码的所有基因按一定的时空顺序依次表达。

3．3 ESCs建系概况
ESCs建系的原理是将早期胚胎或是用外科手术法得到的细胞团或者PGCs，与分化抑制物共同培养，使之增殖而又保持未分化状态，这样代代相传，从而使数量有限的胚胎或者 PGCs 能够成千上万倍的克隆。

第四章 PGCs用于胚胎干细胞培养
4．1 意义
ESCs因其发育的全能性和多样性而备受关注。

虽然来源于PGCs的ESCs与来源于ICM的细胞同属胚胎干细胞系，但相比之下，前者具有着更加巨大的科学意义和实践价值：①由于获得囊胚细胞团来源的ESCs需要破坏具有生命的胚胎，所以这项研究在许多国家是被禁止或严格限制的[7]，而PGC来源于早期流产的胚胎，于是来源于PGCs的EGCs系的建立给研究人员带来了新的希望；②PGcs 是胚胎形成后机体的干细胞，与胚泡期的细胞团相比，经历了着床的筛选，而生理状态下有相当量的胚泡因生长发育不良而不能正常着床并自行排出，因此PGCs 的健康程度应远远高于ICM[8]；③虽然PGCs用于ESCs的培养还存在诸多问题，但无论在数量上还是取材方法上，PGCs的获取均比桑椹胚和囊胚的获取容易,因而更具有实际的应用价值。

4.2 PGCs用于ESCs培养的影响因素
4.2.1 基础培养基的选择
ESCs的体外培养工作要求在严格的无菌条件下进行。

常规使用的培养液有白血病细胞抑制因子(LIF)、胎牛血清、L一谷氨酸、非必须氨基酸(NEAA)以及高浓度的DME等。

因DMEM比较适于生长速度快和呈集落状生长的细胞，而PGCs正符合这一特点。

因此采用DMEM为基础培养液是能够满足胚胎干细胞和饲养层细胞的生长要求的[9]。

4.2.2饲养层对胚胎干细胞的影响
适宜饲养层的使用使得体外培养的PGCs增殖成为可能。

目前广泛应用的饲养层有三种，STO(一种已建系的小鼠胚胎成纤维细胞)、Pmef(小鼠原代胚胎成纤维细胞)。

由于后者所模拟的体外培养条件与PGCs在体生长的环境更为接近。

故更有利于ESCs生长[10]。

近年来，研究人员通过实验发现，以睾丸支持细胞(SCs)作为饲养层与PGCs共饲养，可明显提高PGCs的增殖能力[11]，SCs除可以产生大量CL外，还可产生层粘连蛋白(LN)(一种黏附蛋白)，另外，SCs还能分泌多种源性生长因子和分泌抑制因子，包括LIF、SCF(干细胞生长因子)、bFGF(碱性成纤维细胞因子)等。

因此，从理论上说，可提取动物睾丸SCs，然后将PGCs
与SCs共培养，不仅可促进PGCs贴壁。

而且能有效地抑制体外培养中PGCs的分化，的确是一项值得继续研究与开发的好方法。

第五章 ESCs的应用前景
ESCs的应用最主要的应用是基础科学研究、医学和农业科学等方面，特别是在发育生物学、克隆动物、药学研究以及组织器官的修复移植等方面有着无比广泛的应用前景[12]。

5．1 克隆动物的生产
由于ESCs具有全能性和多能性，并可以在体外增殖、分化，因而是克隆动物的理想材料，ESCs的运用大大加快了家畜育种工作的进程，迅速提高有利于基因及其组合在群体中的比例。

5．2 器官移植ESCs作为一种“种子细胞”
为临床的组织、器官移植提供了大量的材料，hESC经过免疫排斥基因剔除后．再定向诱导终末器官以避免不同个体间的移植排斥，这样就可能解决一直困扰着免疫学界及医学界的同种异型个体间的移植排斥难题。

5．3 组织和器官的修复
由于ES细胞具有多能性，可发育分化为三胚层细胞，即发育分化成机体所有类型组织细胞的能力，任何因物理、化学或生物因素等造成的细胞损伤或病变都可以通过移植由ES细胞定向分化而来的特异组织细胞或器官来治疗。

目前，运用药物或细胞因子诱导ES细胞定向分化为神经细胞[13]、心肌细胞、肝细胞[14]、软骨细胞等已多有报导。

5.4动物发育生物学研究
近年来细胞分化是发育生物学的核心问题之一，至今有许多问题还不清楚，而体外培养PGCs并建立ESCs系提供了在细胞和分子水平上研究哺乳动物发育生物学提供了理想的实验体系。

5.5 药学研究方面
胚胎干细胞系可分化为多种细胞类型，又是能在培养基中不断自我更新的细胞来源。

它发展为胚体后的生物系统，可模拟体细胞与组织间复杂的相互作用，这在药物研究领域具有广泛的用途。

胚胎干细胞有望在短期就能体现的优势在于药物筛选中。

目前用于药物筛选的细胞都来源于动物或癌细胞这样非正常的人体细胞，而胚胎干细胞可以经体外定向诱导，为人类提供各种组织类型的人体细胞，这使得更多类型的细胞实验成为可能。

虽不会完全取代在整个动物和人体上的实验，但会使药品研制的过程更为有效。

当细胞系实验表明药品是安全的且效果良好，才有资格在实验室进行动物和人体的进一步实验。

在候选药物对各种细胞的药理作用和毒性试验中，胚胎干细胞提供了对新药的药理、药效、毒理及药代等研究的细胞水平的研究手段，大大减少了药物检测所需动物的数量，降低了成本。

另外，由于胚胎干细胞类似于早期胚胎的细胞，它们有可能用来揭示哪些药物干扰胎儿发育和引起出生缺陷。

人胚胎干细胞还可以用于其它用途。

由于这类细胞本质上可以无限量地产生人体细胞，它们对于旨在发现稀有人蛋白的研究计划理应有用。

国际上许多制药公司、学者都瞄准了这一重要的研究领域。

近年来，大量实验研究表明多种中药对胚胎干细胞的定向分化有调控作用，这些发现不仅为干细胞的定向分化开辟了新的途径，而且对于中药作用机制的研究、中药新药的研制开发、某些疑难疾病防治水平的提高等都具有重要意义。

第六章胚胎干细胞在眼科的研究现状
6.1胚胎干细胞与角膜
严重的眼表疾病如Stevens-Johnson综合症、化学性烧伤等，可以引起角膜缘上皮细胞缺失，导致球结膜上皮化、角膜新生血管形成和结膜瘢痕，最终导致视力丧失。

虽然目前自体角膜缘干细胞移植[15]和口唇粘膜移植可以成功的进行眼表重建，但一些严重的眼表疾病如Stevens-Johnson综合症，通常是双眼发生病变，且口唇粘膜同时受累，因此，将ESCs诱导形成角膜缘干细胞，为治疗此类疾病提供了新的思路。

王智崇等[16]用表层角膜缘基质接触诱导ESCs，在体外分化成为单一形态的较大细胞，裸鼠皮下移植后形成细胞复层，电子显微镜发现细胞核呈扁平状，细胞表面有微绒毛结构，符合角膜缘干细胞的部分形态学特征，而体外培养条件下，角膜基质剥离面的ESCs细胞仍保持其小细胞状态不变，未经表层角膜缘基质诱导的ESCs细胞裸鼠皮下注射后分化为畸胎瘤样结构，表明表层角膜缘基质的这种微妙的调节微环境具有诱导ESCs细胞定向分化为角膜缘干细胞的潜能。

2001年，喻瓴等将大鼠ESC 细胞与兔角膜缘上皮细胞共同培养以诱导其分化,结果由ESCs分化出的细胞具有上皮细胞表型,并且还表达角膜上皮细胞特异性标志物细胞角蛋白K3/ K12。

最近，Homma等将小鼠ESCs用Ⅳ型胶原接触诱导后形成上皮祖细胞，其角膜上皮细胞特异性标记物K12表达阳性，鳞状上皮细胞标记物K14表达阴性。

然后将诱导后的上皮祖细胞移植到以n－庚醇制备的角膜损伤小鼠模型，移植后24h可见受损角膜重新上皮化，修复细胞来源于移植的干细胞。

有趣的是部分移植细胞呈现基底细胞或翼细胞外观，说明移植细胞同时出现了非角膜上皮细胞的特性。

由此可见，对于双眼完全性角膜缘干细胞缺乏的病例，ESCs很有可能为角膜缘干细胞移植和眼表重建提供充足的细胞来源。

6.2胚胎干细胞与晶状体
目前，人工晶状体植入在白障治疗中得到世界围的广泛应用，其手术方法的安全性是明确的，但是术后的调节问题一直没有得到很好的解决。

2003年，国外研究者[17]以基质细胞来源的诱导活性（stromal cell-derived inducing activity, SDIA）为诱导剂，诱导猴ESCs分化成晶状体细胞，20d后细胞聚集成群，最终形成不同大小的透明体，具有三维结构，免疫组化和Western blot检测显示αA晶状体蛋白和Pax6阳性。

一些细胞群可见色素上皮细胞的存
在。

同时，晶状体细胞的数量随FGF-2浓度和ESCs集落密度的增加而增多。

因此，将ESCs诱导成晶状体细胞，植入到晶状体摘除术后的囊带，是替代人工晶状体治疗白障的一个可能途径，而且可以很好的解决术后调节问题。

6.3胚胎干细胞与视网膜
在眼科领域的研究中，ESCs移植尚处于实验研究阶段，其在视网膜变性疾病及视神经病变治疗中的应用潜能逐渐成为研究的热点。

ESCs既可以作为视网膜神经元发育机制研究的良好模型，也可以为视网膜变性疾病进行细胞移植提供充足的资源。

Schraermeyer 等[18]将ESCs 移植至RCS(Royal College of Surgeons)大鼠的视网膜下腔,结果发现未进行ESCs移植的对照组视网膜外核层细胞发生变性而ESCs移植组外核层仍保留8排左右细胞,说明移植ESCs能延缓视网膜感光细胞的变性。

第七章 ESCs研究面临的难题和挑战
ESCs的成瘤性是目前ESCs移植面临的困难之一。

Arnhold等在移植后的长期观察中，50％的移植眼可以看到畸胎瘤的形成，并侵犯宿主的视网膜，甚至是全眼球受累。

这说明ESCs的无限自我更新和高分化潜能在移植后有形成肿瘤的危险，这就要求在使用ESCs进行治疗前，必须先进行体外诱导ESCs分化产生某种特定的组织细胞或设计自杀基因，当移植的细胞向肿瘤发展时，自杀基因能启动自毁程序使其凋亡。

而且如何控制ESCs分裂增殖中的突变，产生正常的分化细胞仍需大量实验研究。

此外，ESCs的伦理学问题也仍然是目前的争论焦点之一。

ES细胞产生伊始,就以其迷人的魅力征服众多的研究学者,经过近20年的研究。

取得了很大的进展。

1997年,英国罗斯林研究所未报导用体细胞克隆出“多莉”羊以前,应该说ES细胞研究是克隆动物研究的最高档次。

“多莉”羊出生后,引起世界轰动,一时冷落了ES细胞。

但近几年以来,用体细胞克隆出动物出现许多问题,如免疫缺陷,生理异常和老化等问题,这就需要时间去探讨、研究和解决。

人们反过来对ES细胞研究又热了起来,尤其是医学界。

随着胚胎工程技术、基因工程技术、组织工程技术等方面的研究突飞猛进,这些技术与ES细胞结合进行研究已成为现实,将会使相关基础学科研究以及畜牧业、医药工业、临床医学发生重大变革,为人类创造丰富财富。

海峡两岸应组织不同学科、不同领域、不同行业的科技工作者,协同攻关,使该项研究尽快取得突破性进展。

总之， ESCs的自身应用优势虽然为难治性眼科疾病的治疗提供了新的途径，但也存在着大量有待解决的问题。

因此，阐明ESCs的定向分化机制、明确向目的细胞分化的诱导条件、基因修饰ESCs将是未来ESCs研究的发展方向。

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