单倍体细胞培养

• 为了获得充分分散的细胞悬浮液， 应尽可能使用易散碎的愈伤组织， 将愈伤组织在半固体培养基上保存 2～3个继代周期，增加其松散性。
• 在分批培养中，细胞数目增长的变化 情况表现为一条S形曲线（如下图）：
•
对于单细胞、低密度悬浮细胞、或 过于细小的细胞团，不宜直接转到半 固体培养基上培养，先进行液体浅层 培养或看护培养，待形成较大细胞团 后，再转到半固体培养基上诱导愈伤 组织。
5.1 花药培养
• 花药是花的雄性器官，花药培养属器官培养。 • 我国花药培养工作虽然开始较晚，但在短短的时 间内取得了可喜的进展，1974年中国农科院植物 研究所和中国农业科学院烟草研究所，仅仅用了 三年的时间，就培养出世界上第一个作物新品种 ---单育1号烟草品种。
• 花药离体培养的方法是通过花粉粒直接培养出 单倍体植株。花药离体培养法具有技术简单、 诱导容易和诱导频率高等优点,许多栽培物种 都用这种方法获得了单倍体。 • 子房培养是20世纪70年代发展起来的一门新 技术,已经在小麦、玉米、水稻、青稞、大卫 百合、烟草等植物中获得了成功。
方法和步骤： 6）、结果观察
花药培养2-3周后，在载
玻片上加一滴醋酸洋红，
在醋酸洋红中剖开培养的
花药，即可看到幼龄的花
粉胚。培养5周后，花粉
胚形成小植株。
花粉胚形成的小植株
方法和步骤：
7）、当小植株长到适当大小时，取根尖用醋酸 洋红染色，以证实它们的单倍染色体数。
8）、当需要进行染色体加倍时，可将刚长出小
方法和步骤：
4）、接种：剥去萼片和花瓣，将花药取出。由 不同花蕾取出的花药各为一组分别放置。由每 组中取出1个花药，用醋酸洋红压片，以确定花 粉发育时期。 如果在用于压片的花药中花粉正处于适当的发 育时期，即花粉第1次有丝分裂期，则将该花蕾 的所有其余花药进行培养。且接种前必须将花 丝去掉。每瓶培养基接种6个花药。 ５）、培养：花药接种后，放在培养室内，25 ℃条件下见光培养。
• 5.2.2 诱导小孢子脱分化和再分化的措 施
• 1）掌握小孢子脱分化和再分化所需的时间 • 因物种而异，一般从单核早期到双核早期 • 2）诱导小孢子形成胚状体和愈伤组织 • ①选取合适的基本培养基配方 p108
p106
②糖种类和糖浓度合适
较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织； 较低 浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。 • ③植物激素的选用 决定性的作用
• 1、培养基
基本培养基：MS（Murashigc & Skoog，1962）； Nitsch(Nitsch，1969)；N6(朱至清，1974)； B5(Gamborg et al.，1976)。 • 激素：细胞分裂素类（BA、KT Zeatin） • 生长素类（NAA、IAA、2,4-D） • 碳源：单子叶植物（需要的浓度）〉双子叶植 物； 二细胞花粉〉三细胞花粉； • 麦芽糖〉蔗糖
• 5.2.3 分离花粉的方法 p116
• 自然释放法：花蕾消毒后，无菌条件下取出花药， 放在培养基上培养，花药自然开裂，散落在培养基 上，将花药壁去除。效率低 • 研磨过滤收集法： • 剖裂释放法：借助工具剖裂药壁 • 磁拌法：无菌培养皿中放入磁棒 玻璃珠 磁力搅拌 仪上低速旋转
5.2.4花粉培养方法
靠边为准选取花蕾。p107
（3）逆境处理对小孢子脱分化 • 和再分化的影响 • 热激、r射线、秋水仙素、冷激、营 养饥饿、重金属胁迫 • p112 •
由花粉发育成的单倍体植株只有配子一组染色体， 是不能结实的。因而需要将染色体加倍成二倍体。组 织培养中，可能自然加倍，但其频率低。常用的染色
体加倍的办法是用秋水仙碱溶液浸泡小苗。当小苗移
5.2.1 材料的准备
• （1） 材料消毒
• 基本方法：取新鲜未开的花蕾用自来水冲洗10分钟， 用75%的酒精消毒10-15分钟，无菌水冲洗2次，再用 10%漂白粉上清液浸泡20分钟，无菌水冲洗3-4次。然 后将花药放到加有基本培养基的小烧杯中，用注射器 的内管在烧杯的壁上挤压花药，使花粉从花药中释放 出来。用尼龙筛过滤掉药壁组织，滤液再经低速离心 （100-160r/min)，上面的碎片可用吸管吸掉，再加 入新鲜培养基。连续进行两次过滤，到每毫升含103104个花粉的浓度即可。
烟草的蕾期植株
烟草的蕾期植株
方法和步骤：
1）、取材与预处理：
摘取花冠长度为2123mm的花蕾（花冠与 萼片等长，此时单核花 粉行将完成第1次有丝 分裂），置于7-9℃低 温下预处理7天。
不同大小的烟草花蕾
方法和步骤：
2）、配制培养基 MS基本培养基，添加30克蔗糖，5克活性炭。 1号； 不加激素； 2号； 2，4-D 0.2mg/L + BA 0.1mg/L； 3）、烟草花蕾表面消毒 将烟草花蕾在70%酒精中浸数秒，倒掉酒精， 再用0.1%升汞处理8min后，无菌水冲洗4次。
• 植物界,在棉、水稻、咖啡、甜菜、 大麦、大麻、可可、油菜、西红柿、 芦笋和小麦等作物中,都发现过自 发产生的单倍体。某些低等的生物, 如酵母、霉菌和苔藓等,以单倍体 为主要的生活世代。
• 被子植物的花药中，细胞按染色体的
倍性可分为两类：一类为单倍体细胞， 即由花粉中的花粉母细胞减数分裂后 形成的小孢子；另一类为二倍体细胞， 如药隔、药壁及花丝等组织。
基本培养基种类、激素、密度效应与条件培养等。
5.2 花粉培养
• 花粉培养：把花粉从花药中分离出来，以 单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技 术。
• 由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤 组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植 株。且不受花药的药隔，药壁、花丝等体 细胞的干扰。但缺点是比花粉培养难度大。
入培养基前，于无菌条件下，将0.2～0.4％的秋水仙 碱溶液倒入培养瓶中，一般处理24～48小时。倒去秋 水仙碱液，用无菌水洗3次后，再将小苗移至培养基中 继续培养，可能得到一些染色体加倍的再生苗。
• 对于了解再生植株染色体是否加倍成功， 可从形态上加以鉴别；单倍体植株株型矮 小，叶片、气孔、花粉粒都小些，不能结 实。 • 最可靠的办法还是制作染色体玻片标本， 检查染色体数目。
• 花药培养的基本程序包括：①挑选适宜的基因型作 材料；② 确定花粉发育时期；③材料的预处理；④
诱导培养；⑤分化培养； ⑥染色体数观察和染色体
数加倍；⑦花粉植株当代及后代观察鉴定。
• 影响花药培养的因素很多，如材料生理状况和基因
型、接种时期、接种方式(如直插、或平放)、培养方
式(固体、漂浮、液体浅层连续培养、条件培养等)、
控制大麦白化苗的主要措施： 1、田间条件下用10-20MG/L BA处理大 麦花粉。 2、取花粉发育时期处于单核早、中期的 穗子。 3、用4度低温处理离体穗子2-3周 4、提早进行花粉脱分化的转分化培养 5、诱导花粉细胞走胚胎发生途径 6、可加少量的BA，将碳源改为麦芽糖
3烟草花药培养
目的： 掌握花药培养和外植体取材的方法 材料：
（2）选用适宜发育时期的花粉
• 花药培养成功的关键因素之一是花粉发育时 期要合适。一般以单核晚期为宜。有的植物所需 时期可能略早或略晚些。
• 首先要确定合适花蕾的标准。在烟草中一般以花 冠与萼片等长为准。也可通过观察花粉进一步确 定。为此，取大小不同的幼嫩花蕾，从中取出花 药，置于载玻片上，加一滴醋酸洋红染液，挤压 出花粉，染色后在显微镜下观察，以花粉的单核
6.3 单细胞培养
6.3.1单细胞培养方法
1.平板培养法
该培养法为最常用的单细胞培养方法。
2.看护百度文库养法
• 特点:把单个细胞置于一块活跃生长的 愈伤组织上培养,在愈伤组织和培养的 细胞之间,用一块滤纸隔开。
3 微室培养法
1.平板培养：直接取新鲜花药的花粉粒在平板培养基上进行培养的方法
2. 液体培养：比固体培养法效果好。将花药接种到液体培养基内，在摇床上 振荡（100转/分钟），诱导产生胚状体或悬浮细胞培养。需要定期更换 培养基（在超净工作台上静置沉淀，去上清，然后加入新培养基）。 3. 双层培养(固-液培养）固相和液相双层培养。 4. 看护培养：将花药水平放于固体培养基上，在其上覆盖小圆形滤纸，在滤 纸滴加0.5ml含10个花粉粒的悬浮液滴的培养方法。 5. 微室培养：将一滴花粉悬液滴在盖玻片上，在翻过来放在凹穴载玻片上， 盖玻片四周用石蜡密封。 6.预培养：将花药先悬浮培养2-4天（50个花药/5 ml），再挤出花粉，经离 心洗涤纯化后悬浮培养。 7.哺育培养：将在合适培养基上培养裂开的花药作为哺 育组织，将预培养的花粉接种在其中的方法。
• 单倍体植株不存在显隐性的问题，一旦发 生突变，即可以表达。 • 理想的诱变方法是利用化学药物或者辐射 处理。对于单倍体细胞的培养物（包括愈 伤组织、原生质体、小孢子等），将其进 行诱变，可以使植物育种微生物化，在过 去的10多年的研究中，已经取得了令人满 意的结果。
• 花药培养的意义
1.同常规的育种方法相比，利用花药培养可以 大大缩短育种年限。 2.利用花药培养的单倍体育种较常规育种便于 根据表现型进行选择。 3. 单倍体加倍的纯度，较常规的自交选育出 来的自交系纯度要高的多。 • 4.对于自交不亲和的物种可以获得杂交种子。 5.在远源杂交方面具有较大的利用价值。
植株不久的花药浸入灭过菌的浓度为0.5%的秋
水仙素溶液中24-48小时，然后用无菌水洗净，
将小植株接入无激素培养基中培养。
6 细胞培养
6.1前言
• 使用单细胞系统比使用完整的器官 或植株有更大的优越性。使用游离细胞 系统时，可以让各种化学药品和放射性 物质很快作用于细胞，又能很快停止作 用。通过单细胞克隆，可以将微生物的 遗传学技术应用于高等植物的作物改良。
蔗糖浓度
培养基中蔗糖浓度比其它组织培养高，尤其 早期培养，一般5%—10%。原因是花粉母细胞 的渗透压比花丝等体细胞高，即高浓度的蔗糖 不利于药壁、花丝等体细胞的生长，而利于花 粉的生长。
激素 2，4-D的浓度从0.2mg/L起，随着浓度的 提高，花粉愈伤组织出现频率的增高趋势。但 是有几种籼稻相反。
花药
花粉粒
5.3
移栽驯化
• 花粉植株弱小，移栽难。 • 关键---保持高空气湿度（80-90% ， 1-2周）； • 低土壤湿度。
白化苗
• 禾本科植株的花药培养中经常出现白化苗 • 原因很多---没有完好的叶绿体，缺乏叶绿 素，只能异养生长。 • 内因---植株基因型、花药、花粉发育时期 的影响最为明显。 • 外因--- ，外部因素为高温、高浓度的2， 4-D、延迟转分化培养时间等。但是机理目 前还不清楚。
6.2 单细胞的分离
6.2.1 由完整的植物器官分离单细胞 1. 机械法
将植物叶片放入研钵中 → 加入 研磨介质轻轻研磨 → 匀浆用纱布过 滤 → 在研磨介质中低速离心 → 分 离出具光合活性和呼吸活性的叶肉细 胞。
•和酶解法相比，机械法具有的 优点：
• ① 细胞不会受到酶的伤害 • ② 无须质壁分离
• 2. 酶解法
• 优点：有可能得到海绵薄壁细胞或 栅栏薄壁细胞的纯材料。
6.2.2 由愈伤组织中分离单 细胞
• 方法： • 将易散碎未分化的愈伤组织转入
液体培养基中 → 常温、弱光（或 黑暗）下震荡培养 → 继代、淘汰 细胞碎片 → 得到单细胞或小细胞 团。
震荡培养中震荡的作用: • ① 对细胞团施加缓和压力,使其破碎成小细 胞团和单细胞 • ② 使细胞和小细胞团在培养基中保持均匀分 布 • ③ 促进培养基和容器内空气之间的气体交换
•5 单倍体细胞培养
• 单倍体细胞培养包括三个方面：花药培养、小 孢子培养、未受精子房及卵细胞培养。
• 根据物种倍性不同，单倍体可以分为两大类： 一类是一倍单倍体,即二倍体物种产生的单倍 体；
• 另一类是多倍单倍体,即起源于多倍体物种 （如4x、6x）。
• 花药培养是指未成熟的花药接种在人工 培养基上分化为植株的过程。由于这种 分化植株起源于花药中的未成熟的花粉， 所以，人们常将花药培养和花粉培养相 提并论。 • 花药和花粉分属于不同的范畴，即花药 是一个植株体上的器官，属于器官培养； • 而花粉则在一般意义上 ，是一个单细胞， 应该属于细胞培养的范畴。