小鼠GITRL基因的克隆和序列分析

第14卷第2期2004年4月 江苏大学学报(医学版)

Journal of Jiangsu University(medicine)

Vol.14No.2

Apr.2004

小鼠GITRL基因的克隆和序列分析

王胜军1,2,马 斌1,仝 佳1,许化溪1,杨胜利2

(1.江苏大学医学技术学院免疫学研究室;2.江苏大学生命科学研究院,江苏镇江212001)

[摘 要] 目的:克隆小鼠GITRL基因全长编码区的cDNA,同时对其序列分析。方法:采用RT PCR方法,从小鼠树突状细胞获得GITRL基因的cDNA,克隆至pMD18 T载体,选择阳性克隆并进行序列测定。结果:扩增得到的GITRL基因编码区cDNA的全长519bp,编码173个氨基酸残基,与GeneBank中发表的序列完全一致。结论:获得小鼠GITRL基因的克隆,为进一步研究其生物学功能提供基础。

[关键词] GITRL基因;cDNA克隆;RT PCR;调节性T细胞;小鼠

[中图分类号] R394 [文献标识码] A [文章编号] 1671-7783(2004)02-0097-04

Cloning and Sequence Analysis of Mouse Glucocorticoid induced

Tumor Necrosis Factor Receptor Ligand Gene

WANG Sheng jun1,2,MA Bin1,TONG Jia1,XU Hua xi1,Y ANG Sheng li2

(1.Department of Immunol ogy,School of Medical Technology,Jiangsu Universi ty,Zhenjiang Jiangs u212001,China;

2.Li fe Science Institute,Jiangs u University,Zhenjiang Jiangs u212013,China)

[Abstract] Objective:To clone and analyze the cDNA enc oding mouse glucoc orticoid induced tumor necrosis fac tor receptor ligand(G ITRL)gene,a type transmembrance protein of the tumor necrosis factor(TNF)su perfamily.Methods:The c DNA of GITR L was amplified from total RNA e xtracted from mouse dendritic cells (DC)by RT PC R and inserted into pMD18 T vector,and the sequence of the DNA was analyzed.Results:The c DNA of GITRL has the length of519bp with an complete open reading frame,which encodes a product of173 a mino acid and shares100%homology with the sequence of mRNA for mouse G ITRL in GeneBank.Conclu sion:The cDNA of G ITRL was successfully cloned,which brought a founda tion for further researching on its bio logical function.

[Key words] Glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor ligand;cDNA cloning;RT PCR;Dendrit ic cell;Mouse

小鼠GI TR(glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor)最初是1997年Nocentini等人[1]在地塞米松诱导T细胞杂交瘤细胞中发现的膜蛋白受体,由228个氨基酸组成,富含半胱氨酸的重复结构域,但不含DD结构域(death domain),具有许多TNF 受体超家族的特征,被命名为TNFRSF18,随后人类对应的蛋白也被发现[2]。2003年12月Tone[3]和Kime[4]等人同时发现其配体G ITRL,初步研究结果表明GI TRL具有阻断C D4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)免疫抑制功能的作用。本研究从小鼠树突状细胞(dendritic cells,DCs)中通过RT PCR扩增出G ITRL的cDNA,并进行序列分析。

1 材料和方法

1 1 材料

RPMI1640及胎牛血清为Gibc o公司产品,小鼠GM CSF、TNF 为Peprotech公司产品,PE标记抗小鼠H 2Kd单克隆抗体及FI TC标记抗小鼠CD11c单克隆抗体为BD Pharmingen公司产品,Trizol及逆转

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(30300169)和江苏省社会发展资助项目(BS2000026) [作者简介]王胜军(1969-),男,江苏镇江人,副教授,主要从事免疫调节研究。

录试剂盒为Invitrogene 公司产品,Ex TaqDNA 聚合酶、dNTP 、EcoRI 及SalI 核酸内切酶、pMD18 T vector 为Takara Biotec 公司产品,x gal 和IP TG 为Sigma 公司产品,DL2000和La mbda DNA/EcoRI+HindIII 分子质量标准分别为Takara Biotec 公司和MBI 公司产品,PCR 产物纯化试剂盒为Macherey Nagel 公司产品,质粒提取试剂盒为Qiagen 公司产品,大肠杆菌DH5 为本室保存。1 2 引物设计与合成

根据GenBank 中小鼠GI TRL 基因ORF 序列,通过Primer Premier 5 0软件设计引物,由上海博亚生物技术有限公司合成。引物序列如下:

P1:5 GTT C TC ATT CC A TC A GAG AAC G-3 P2:5 C TA AGA GAT GAA TGG TAG ATC AGG -3

1 3 DCs 诱导及鉴定

断颈处死小鼠,取股骨骨髓,洗涤计数,用含200U/ml GM CSF 的完全RPMI1640培养基将细胞浓度调整为2!105/ml,在每只10c m 的细胞培养皿中加入10ml;第3天后加入含200U/mlGM CSF 的完全RPMI1640培养基10ml,第6天和第8天用含100U/ml GM CSF 的完全RPMI1640培养基换半液,第10天加入终浓度为200U/ml TNF ,第12天收获细胞,洗涤,荧光染色,通过流式细胞仪分析细胞纯度。

1 4 RT PCR 扩增GI TRL cDNA

取2!106DC,加入1ml Trizol,提取总RNA,根据逆转录试剂盒提供的方法将总RNA 反转录为cD NA,以其为模板进行PCR 扩增。25 l PCR 反应体系包括2 5 l 10!buffer 、2 l 2 5mmol/L MgCl 2、2 5 l 2mmol/L dNTP 、2 l cDNA 、0 25 l Ex Taq 酶(5U/ l)、1 l P1及P2引物、13 75 l H 2O 。PCR 反应条件为:94∀预变性2 5min,然后94∀变性30s,60∀退火30s,72∀延伸1min,共进行35次循环,再72∀延伸5min 。PCR 扩增产物进行琼脂糖(10g/L)电泳,EB 染色,分析鉴定。1 5 GITR L c DNA 克隆及鉴定

GITRL 基因PCR 扩增产物通过Macherey Nagel 公司的NucleoSpin 试剂盒进行回收。将回收的产物与pMD18 T vector 载体连接,转化D H5 宿主菌,接种含有氨苄西林、x gal 和IPTG 的LB 平板,挑取菌落,转种LB 培养基,抽提质粒,酶切,电泳鉴定。1 6 GITR L c DNA 的序列测定与分析

将经过鉴定的阳性重组质粒,使用M13F/R 通

用引物进行双向反应测序,将测定的核苷酸序列与GeneBank 中原有序列进行比较分析。2 结 果

2 1 DC 细胞纯度分析

小鼠骨髓细胞经GM CSF+TNF 诱导培养后,通过流式细胞仪分析,细胞表面MHCII 分子H 2Kd 为88 49%,DC 特征性表面分子CD11c 为83 82,结果见图1。

图1 小鼠DC 细胞流式细胞仪分析结果

2 2 G ITRL 基因RT PCR 扩增结果

DC 细胞抽提总RNA,以反转录产物为模板,采用特异的GITR L 引物,通过PC R 扩增得到目的基因,长度在519bp,与目的片段基本一致(图2)。2 3 重组质粒的筛选与鉴定

将PCR 产物与pMD18 T vector 载体连接,连接产物转化DH5 菌,随机挑取白色菌落,抽提质粒,双酶切、电泳后,阳性克隆条带分别为2692bp 和519bp 左右,结果见图3。2 4 测序结果及分析

我们克隆出的目的基因,测序结果显示其编码

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