东南大学生化王大勇第7章

• 如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核 糖体或可溶性的细胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开，收集 该细胞组分作为下步纯化的材料。
2.粗分级分离
• 当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后， 需要将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。
• 一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分 级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大．既能 除去大量杂质（包括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。
• 某些酸类指的是三氯醋酸，磺基水杨酸和硝酸等。
• 当溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生 物碱试剂和酸类的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉 淀。这类沉淀反应经常被临床检验部门用来除去体液中干 扰测定的蛋白质。
加热变性沉淀法
• 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类促进蛋白质加 热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速。
• Protein stays in; small molecules pass through.
透析：是利用蛋白质等大分 子不能通过半透膜的性质， 使蛋白质和其它小分子物质 如无机盐单糖等分开。常用 的半透膜：
•玻璃纸（赛璐玢纸， cellophane paper）
•火绵纸（赛璐玎纸, celloidin paper）
Section 3: Colloid property and precipitation
Protein solution is a hydrophilic colloid(1-100nm);
1) Why are protein colloids stable? ①hydration mantle/水化膜 ②charges ③Brown movement
Chapter 7: Properties and purification of proteins
Why do you need to purify the protein?
• Sequence analysis • Structural studies • Raise antibodies • Identify sites of modification • Functional studies
结晶：蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋 白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优 势时才能形成结晶。重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。蛋 白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然 状态的有力指标。
前
生物组织
处
破碎、差速离心、溶解膜蛋白等
理
无细胞提取液
粗
分段盐析、有机溶剂 分级沉淀、凝胶层析
重金属盐沉淀法
• 当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，这样它就 容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。
• 误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行 解救就是因为它能和重金属离子形成不溶性盐，然后再服 用催吐剂排出体外。
生物碱试剂和某些酸类沉淀法
• 生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，如骤酸即 2，4，6-三硝基酚、钨酸和碘化钾等。
A
B
3) Density gradient centrifugation
密度梯度离心
Sediment velocity depends on weight, density and shape of a particle.
Sucrose gradient Polysucrose gradient
生物大分子及颗粒的沉降不仅决 定于它的大小，而且也取决于它 的密度。
2. 蛋白质的沉淀
如果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会 从溶液中沉淀出来。蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷 和水化作用有关。
◇ 盐析法 ◇ 有机溶剂沉淀法 ◇ 重金属盐沉淀法 ◇ 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 ◇ 加热变性沉淀法
盐析法
• 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸胺、硫酸钠或氯 化钠等），使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。
Section 1: Properties of protein
蛋白质的酸碱性质
• 对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷和负电荷 恰好相等，也即净电荷为零，这一pH称为蛋白质的等电点。
蛋白质的酸碱性质
Section 2: Size and shape Methods for measuring protein MW
Complicated and specific “Black art”
SELECT SOURCE OF MATERIAL
• Concentration: choose tissue, organism with high production/concentration of target protein
• ◇ 1.前处理 • ◇ 2.粗分级分离 • ◇ 3.细分级分离
1.前处理
• 植物组织和细胞：由于具有由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的 细胞壁，一般需要用与石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方 法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。
• 细菌：整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽肽 聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波震 荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）等。组织和 细胞破碎以后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。细胞碎 片等不溶物用离心或过滤等方法除去。
①dialysis/透析& ultrafiltration/超滤法 Remove small molecules or ions ②density gradient centrifugation密度梯度离心 ③gel filtration/凝胶过滤法
1) Dialysis／透析
• semi-permeable membrane. • Pores of membrane are of a certain size.
2. In terms of solubility
Isoelectric precipitation Salting in and salting out Organic solvent precipitation
1.等电沉淀和pH控制
• 蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子 之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。利用蛋白质在等电点时 溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。
颗粒在具有密度梯度的介质中离 心时，质量和密度大的颗粒沉降 的快，并且每种蛋白质颗粒沉降 到与自身密度相等的介质密度梯 度时，即停止不前，最后各自在 离心管中被分离成独立的区带。
分成区带的样品可以在管底刺一 个小孔逐滴放出，分步收集。常 用的介质有蔗糖、氯化铯等。
滴加样品
离
心
管
蔗糖浓度
蔗糖密度梯度
4)Gel Filtration／凝胶过滤层析
★molecular weight/MW ★solubility ★charge difference ★selective adsorption ★ligand specificity（亲和层析） ★hydrophobic property
1、According to size and shape
• 加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性是蛋白质 天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白 质处于等电点也破坏了带电状态。
• 我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤 （含MgCl2 )的制豆腐的方法，这是成功的应用加热变性沉淀蛋 白质的一个例子。
Section 4: General principles about protein purification
by gel filtration
Electrophoresis/电泳
SDS—PAGE
Electrophoretic mobility depends on: Charges Mass or size shape
SDS， 有效变性剂，带负电荷 巯基乙醇，打开二硫键
蛋白质亚基在电场中的行为只与分子大小有关。
如一NH2，-COOH,-OH以及 –CO-NH-等，在水溶液中能与水分 子起水化作用，使蛋白质分子表面形成一个水化层。 • 蛋白质分子表面上的可解离基团，在适当的pH条下．都带有 相同的净电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层。 • 蛋白质溶液由于具有水化层—— 双电层两方面的稳定因素， 所以作为胶体系统是相当稳定的。 • 蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有丁达尔效应、布朗 运动以及不能通过半透膜。
• Developmental stage: Does level of protein change with development?
• Subcellular localization • Use of expression system
Protein purification
• Pretreatment/预处理 • Rough fractionation/粗分级 • Fine fractionation/细分级
分 离
选择性沉淀法
电泳
离子交 换层析
凝胶 亲和 疏水 过滤 层析 层析
吸附 层析
细
分
离
精制后的蛋白质 可结晶纯化
Section 5:
Methods for Protein Purification
Take advantage of the following properties of different protein.
蛋白质分子的大小和形状
• 蛋白质分子量很大，相对分子量变化范围在6000-1000000或 更大一些。
• 测定蛋白质分子量的方法： • 1.根据蛋白质化学组成测定最低相对分子量 • 2.渗透压法测定相对分子量 • 3.蛋白质的扩散和扩散系数 • 4.沉降分析法测定蛋白质相对分子量 • 5.凝胶过滤法测定相对分子量 • 6.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子量
Column made of porus beads Separates in terms of size Big proteins elute first
凝胶过滤
原理：它是60 年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子 大小不同进行分离的一种方法。由于被分离物质的分子大 小（直径）和形状不同，洗脱时大分子物质由于直径大于 凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙 ，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小 分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔 ，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。
• 一般不引起蛋白质变性;当除去盐后，复可溶解。
有机溶剂沉淀法
• 向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂（甲醇、乙醇 或丙酮等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数 而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集 而沉淀。
• 有机溶剂沉淀法，如果控制在低温下操作并且尽量缩短处 理的时间则可使变性速度减慢。
• 其他改型纤维素材料
半透膜袋 蛋白质溶液 透析液 磁棒
磁力搅拌器
2）超过滤
利用压力、抽滤（A）或 （ultrafiltration）
离心力（B）等多种形式
，强行使水和其它小分子
滤膜
溶质通过半透膜，而蛋白
抽气
质被截留在膜上，以达到
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浓缩和脱盐目的。
离心
滤膜
滤膜有多种规格，可选择 性的截留相对分子量不同 的蛋白质。
1. 蛋白质的胶体性质
分散相质点在胶体系统中保持稳定，需要具备3个条件： 第一，分散相的质点大小在1～100nm范围内，动力学上稳定，在 介质中作布朗运动； 第二，分散相的质点带有同种净电荷，互相排斥，不易聚集成大 颗而沉淀； 第三，分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层
蛋白质的胶体性质
• 蛋白质的分子大小属于胶体质点范围。 • 蛋白质溶液是一种亲水胶体，蛋白质分子表面的亲水基团，
• 有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓 缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方 法（如聚乙二醇浓缩法）进行浓缩。
3.细分级分离
一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以 及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等 电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般 规模较小，但分辨率很高。