手性高效液相色谱法
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手性HPLC法
直接法和间接法异同点 均以现代色谱分离技术为基础，引入手性 环境(不对称中心)，使药物对映体间呈现理化 性质的差异而实现分离，不同的是间接法是将 其引入分子内，而直接发引入分子间。
10
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手性衍生化试剂法
对映异构体与手性试剂反应，产生相应的非对 映异构体
( R) SA ( R) SE ( R) SA ( R) SE (S ) SA ( R) SE (S ) SA
16
基本原理
在HPLC流动相中加入光学纯反离子可与流动 相中的对映体生成非对映体复合物，离子对复合物 之间具有不同的稳定性和分配性质，并可与固定相 发生不同的静电，疏水和氢键作用，进而差速迁移 得以分离。
17
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3.配基交换型手性添加剂
配基交换原理： 在流动相缓冲溶液中加入金属离子和配位 体交换剂形成二元络合物，药物对映体再与其 形成稳定性不同的三元络合物而达到手性分离。 常用的手性配合试剂：氨基酸及其衍生物 如L-苯丙氨酸，L-脯氨酸等配位金属有 Cu2+、 18 Zn2+、Ni2+、Cd2+等。
色谱柱：Aglient Zorbax C18 （250mm×4.6mm，5μm） 流动相：乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲 盐（55:45，用磷酸调pH至4.5） 流速：0.75 ml/min 24 检测波长：224nm 进样量：20μl 柱温：室温
24
艾司洛尔
应用实例
样品处理和手性衍生化方法：
常用手性添加剂有： 环糊精类 手性离子对试剂 13 配基交换型等
13
1.环糊精类手性添加剂
环糊精的手性识别主要 来自环内腔对芳烃或脂肪烃 侧链的包合作用以及环外壳 上的羟基与药物对映体发生 氢键作用。
14
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环糊精分类-根据空腔大小
α-环状糊精
适合于分子量小的药物对映体分析
β-环糊精
适合于多数对映体的位阻和电子特征
γ-环糊精
15
适合于较大分子药物的对映体分析
15
2.手性离子对色谱法
一类分离可解离对映体的离子对色谱法，已成功分 离了β-氨基醇类、氨基醇类、胺类等对映体化合物。 有机酸或碱能与离子对试剂在流动相中反应生成低 极性不解离的“离子对”，但反相离子对色谱很少用于 手性药物分离，而正相离子对色谱广泛用于药物对映体 的分离。 16
20
蛋白质类固定相
具有大量可与样品分子结合的部位，样品分 子的保留和选择易受流动相等因素影响，因此具 有较高的手性选择性，是HPLC分离中最具有吸 引力的手性固定相之一。 目前使用较多的蛋白质CSP： 以牛血清蛋白（BSA）、人血清蛋白（HAS） 和α1-酸性糖蛋白（AGP ）通过氨基酸键合到微粒 21 硅胶上制成，商品名为Chiral AGP、Resolvosol和 Enantio Pac等。
SE为光学活性试剂，称为“选择器”， 11 SA为手性溶质，称为“选择靶”。
11
手性衍生化试剂法
常用的CDR试剂主要有：
羧酸衍生物、胺类、异硫氰酸酯和 异氰酸酯类、光学活性氨基酸类等。
12
12
手性流动相法
不必事先将样品制备成衍生物，只需将手性 试剂加入到流动相中，手性添加剂与样品形成各 种手性络合物，根据形成的复合物的稳定常数不 同而获得分离。
7
手性HPLC法
手性流动相添加法 (CMP)
直接法 手性固定相法 (CSP)
引入“手性识别试剂”或者“手性 环境”（手性固定相、手性流动相添加 剂）至色谱系统中。8
8
手性HPLC法
间接法：又称柱前衍生化法（CDR） 药物对映体在分离前先与具有高光学纯度 的手性衍生化试剂（chiral derivatization reagent, CDR）反应，形成一对非对映异构体，再以常 规固定相进行分离。
6 对映体分离方法包括：非色谱法和色谱法。
6
非色谱法和色谱法
传统的拆分方法为非色谱法： 如分步结晶法，具有很大的局限性，操作过程繁 复、耗时，难于进行微量分离和测定。 大多采用色谱法： 包括TLC、GC、HPLC、CE和超临界流体色谱法等， 在分离和检测光学对映体纯度的方面已成为一种重要 7 的手性拆分手段。
手性药物(chiral drug)： 含有手性中心的药 物。手性中心即为化ห้องสมุดไป่ตู้ 物中某个碳原子上连接4 个互不相同的基团时， 称该碳原子被称为手性 中心。
4
4
手性药物临床使用-沙利度胺
5
5
手性药物拆分方法与机制
拆分基础：创造手性环境和构造非对映异构体。 拆分原理：基于把对映体的混合物转变成非对映异 构体，再利用它们在物理化学或化学性质上的差异 使之分开。
内标S-普萘洛尔和 6％高氯酸300 μl 10000 r/min 4℃ 离心10 min 150 μl 1.0 mol/L 氢氧化钠 1.5 ml磷酸缓冲液(pH 7)
取血样 0.5mL
混匀
取上 清液
混匀
活化
50 μl GITC乙腈液和5 μL 0.5％三 乙胺，30℃恒温反应30 min，吹干
18
手性固定相拆分法
CSP是通过物理吸附或化学键合法把手性 化合物键合到固定相载体上。根据固定相材料， 又可分为手性聚合物型、蛋白质类、环糊精类 固定相。
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手性聚合物型固定相
目前使用量大、适用面较广的一类CSP，纤维 素衍生物手性固定相大都属于该类。
以β-葡萄糖为结构单元的天然光活性线性高 20 聚物，每个结构单元有一个伯羟基和两个仲羟基， 分别位于C6 和C2、C3 位上。
第十九章
现代药物分析技术
目录
1 2 3
手性高效液相色谱法
毛细管电色谱法 超高效液相色谱法 质谱及其联用技术
4
第一节 手性高效液相色谱法
对映体(enantiomer)： 在空间上不能重叠， 互为镜像关系的立体异 构体。立体异构体指分 子中的结构基团在空间 三维排列不同的化合物。 3
3
手性高效液相色谱法
21
环糊精类固定相
CD在HPLC中可将其键合到合适的载体上制 备CSP，CD空腔内部只有氢原子及糖苷氧原子具 有疏水性，空腔端口的羟基使CD外部具有亲水性， 每个葡萄糖单元又有5个手性碳原子，因此CD具 有手性识别作用。
22
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三种手性HPLC分离方法的比较
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应用实例
手性衍生化HPLC测定血浆中艾司洛 尔及其代谢物对映体
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手性HPLC法
直接法和间接法异同点 均以现代色谱分离技术为基础，引入手性 环境(不对称中心)，使药物对映体间呈现理化 性质的差异而实现分离，不同的是间接法是将 其引入分子内，而直接发引入分子间。
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手性衍生化试剂法
对映异构体与手性试剂反应，产生相应的非对 映异构体
( R) SA ( R) SE ( R) SA ( R) SE (S ) SA ( R) SE (S ) SA
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基本原理
在HPLC流动相中加入光学纯反离子可与流动 相中的对映体生成非对映体复合物，离子对复合物 之间具有不同的稳定性和分配性质，并可与固定相 发生不同的静电，疏水和氢键作用，进而差速迁移 得以分离。
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3.配基交换型手性添加剂
配基交换原理： 在流动相缓冲溶液中加入金属离子和配位 体交换剂形成二元络合物，药物对映体再与其 形成稳定性不同的三元络合物而达到手性分离。 常用的手性配合试剂：氨基酸及其衍生物 如L-苯丙氨酸，L-脯氨酸等配位金属有 Cu2+、 18 Zn2+、Ni2+、Cd2+等。
色谱柱：Aglient Zorbax C18 （250mm×4.6mm，5μm） 流动相：乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲 盐（55:45，用磷酸调pH至4.5） 流速：0.75 ml/min 24 检测波长：224nm 进样量：20μl 柱温：室温
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艾司洛尔
应用实例
样品处理和手性衍生化方法：
常用手性添加剂有： 环糊精类 手性离子对试剂 13 配基交换型等
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1.环糊精类手性添加剂
环糊精的手性识别主要 来自环内腔对芳烃或脂肪烃 侧链的包合作用以及环外壳 上的羟基与药物对映体发生 氢键作用。
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环糊精分类-根据空腔大小
α-环状糊精
适合于分子量小的药物对映体分析
β-环糊精
适合于多数对映体的位阻和电子特征
γ-环糊精
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适合于较大分子药物的对映体分析
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2.手性离子对色谱法
一类分离可解离对映体的离子对色谱法，已成功分 离了β-氨基醇类、氨基醇类、胺类等对映体化合物。 有机酸或碱能与离子对试剂在流动相中反应生成低 极性不解离的“离子对”，但反相离子对色谱很少用于 手性药物分离，而正相离子对色谱广泛用于药物对映体 的分离。 16
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蛋白质类固定相
具有大量可与样品分子结合的部位，样品分 子的保留和选择易受流动相等因素影响，因此具 有较高的手性选择性，是HPLC分离中最具有吸 引力的手性固定相之一。 目前使用较多的蛋白质CSP： 以牛血清蛋白（BSA）、人血清蛋白（HAS） 和α1-酸性糖蛋白（AGP ）通过氨基酸键合到微粒 21 硅胶上制成，商品名为Chiral AGP、Resolvosol和 Enantio Pac等。
SE为光学活性试剂，称为“选择器”， 11 SA为手性溶质，称为“选择靶”。
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手性衍生化试剂法
常用的CDR试剂主要有：
羧酸衍生物、胺类、异硫氰酸酯和 异氰酸酯类、光学活性氨基酸类等。
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手性流动相法
不必事先将样品制备成衍生物，只需将手性 试剂加入到流动相中，手性添加剂与样品形成各 种手性络合物，根据形成的复合物的稳定常数不 同而获得分离。
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手性HPLC法
手性流动相添加法 (CMP)
直接法 手性固定相法 (CSP)
引入“手性识别试剂”或者“手性 环境”（手性固定相、手性流动相添加 剂）至色谱系统中。8
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手性HPLC法
间接法：又称柱前衍生化法（CDR） 药物对映体在分离前先与具有高光学纯度 的手性衍生化试剂（chiral derivatization reagent, CDR）反应，形成一对非对映异构体，再以常 规固定相进行分离。
6 对映体分离方法包括：非色谱法和色谱法。
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非色谱法和色谱法
传统的拆分方法为非色谱法： 如分步结晶法，具有很大的局限性，操作过程繁 复、耗时，难于进行微量分离和测定。 大多采用色谱法： 包括TLC、GC、HPLC、CE和超临界流体色谱法等， 在分离和检测光学对映体纯度的方面已成为一种重要 7 的手性拆分手段。
手性药物(chiral drug)： 含有手性中心的药 物。手性中心即为化ห้องสมุดไป่ตู้ 物中某个碳原子上连接4 个互不相同的基团时， 称该碳原子被称为手性 中心。
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手性药物临床使用-沙利度胺
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手性药物拆分方法与机制
拆分基础：创造手性环境和构造非对映异构体。 拆分原理：基于把对映体的混合物转变成非对映异 构体，再利用它们在物理化学或化学性质上的差异 使之分开。
内标S-普萘洛尔和 6％高氯酸300 μl 10000 r/min 4℃ 离心10 min 150 μl 1.0 mol/L 氢氧化钠 1.5 ml磷酸缓冲液(pH 7)
取血样 0.5mL
混匀
取上 清液
混匀
活化
50 μl GITC乙腈液和5 μL 0.5％三 乙胺，30℃恒温反应30 min，吹干
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手性固定相拆分法
CSP是通过物理吸附或化学键合法把手性 化合物键合到固定相载体上。根据固定相材料， 又可分为手性聚合物型、蛋白质类、环糊精类 固定相。
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手性聚合物型固定相
目前使用量大、适用面较广的一类CSP，纤维 素衍生物手性固定相大都属于该类。
以β-葡萄糖为结构单元的天然光活性线性高 20 聚物，每个结构单元有一个伯羟基和两个仲羟基， 分别位于C6 和C2、C3 位上。
第十九章
现代药物分析技术
目录
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手性高效液相色谱法
毛细管电色谱法 超高效液相色谱法 质谱及其联用技术
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第一节 手性高效液相色谱法
对映体(enantiomer)： 在空间上不能重叠， 互为镜像关系的立体异 构体。立体异构体指分 子中的结构基团在空间 三维排列不同的化合物。 3
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手性高效液相色谱法
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环糊精类固定相
CD在HPLC中可将其键合到合适的载体上制 备CSP，CD空腔内部只有氢原子及糖苷氧原子具 有疏水性，空腔端口的羟基使CD外部具有亲水性， 每个葡萄糖单元又有5个手性碳原子，因此CD具 有手性识别作用。
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三种手性HPLC分离方法的比较
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应用实例
手性衍生化HPLC测定血浆中艾司洛 尔及其代谢物对映体