绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达

绿色荧光蛋白(GFP) 基因的克隆和表达
背景知识
绿色荧光蛋白(green fluoresce nt protein , GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔
肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。

它产生荧光无需
底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。

GFP由3个外显子组成，长 2.6kb； GFP是
由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为 27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受
60C处理。

1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm , 宽240 nm,由11个围绕中心a螺旋的反平行B折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开
始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对
荧光活性很重要
的生色团则位于大空腔内。

发色团是由其蛋白质内部第65-67位的
Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成.
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水
桶样结构，长420 nm，宽240 nm,由11个围绕中心a螺旋的反平行B折叠组
成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部
由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性
很重要的生色团则位于大空腔内。

实验一质粒DNA 的分离与纯化
一、实验目的
掌握一种最常用的质粒DNA 提取方法：碱裂解法。

该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA ，比较方便、省时，提取的质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。

二、基本原理
质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。

迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到 200kb 。

质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

在大多数情况下质粒DNA 复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。

有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达10-200 个拷贝。

当宿主细胞的蛋白质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒 DNA 可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。

质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒DNA 用人为的方法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。

借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。

质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA 分子。

目前已有许多方法可用于质粒 DNA 的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒 DNA 的分离；质粒 DNA 的纯化。

1、细菌的生长和质粒的扩增
从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。

对于松弛型质粒（如pUC 系列）来说，只要将培养物放到标准的 LB 或 2YT 培养基中生长到对数晚期，
3、质粒 DNA 的提纯
对于小量制备的质粒 DNA ，经过苯酚抽提、 蛋白质及 RNA ，达到纯化的目的。

质粒 DNA 分子具有三种构型：共价闭合环形 构型）和线性分子（ L 构型）。

在细菌体内，质粒 胶电泳中不同构型的同一种质粒 最前沿的是 SC DNA ，其
后依次是
三、实验材料、仪器及试剂
RNA 酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残余
DNA （cccDNA ， SC 构型）、开环 DNA （OC DNA 是以负超螺旋构型存在的。

在琼脂糖凝
DNA ，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。

其中走在 L DNA 和 OC DNA 。

就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒 DNA 。

但对于严谨型质粒（如 pBR322 ）来说， 则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩
2、菌体的收集、裂解和质粒 DNA 的分离 质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株） DNA 与质粒 DNA 之间的两种 主要性质差异： （ 1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒 DNA 大得多。

（ 2）从细胞中提取得
到的大肠杆菌 DNA 主体是变性的线性分子，而大多数质粒 DNA 是共价闭合的环状分子。

这里 主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入 SDS （十二烷基硫酸钠）和 NaOH 使菌体
裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁） 。

此处理可破坏碱基配对， 故可使细菌的线状染色体 DNA 变性，但闭环质粒 DNA 链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。

当条件恢复正常时 （如 加入酸性的NaAc 或Kac 中和碱性NaOH ），质粒DNA 链迅速得到准确配对，重新恢复成天然 的超螺旋分子。

通过离心，可以
使染色体 DNA 与变性蛋白质、 RNA 分子一起沉淀下来，而质 粒超螺旋分子仍滞留于上清中。

1. 在含有pEGFP — N3质粒的DH5a 平板上菌落上挑取菌种，
置于含有5mL LB 培养基的试管中。

摇晃过夜。

在含有 pET-28a 质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样摇荡培养过夜。

2、 使用仪器
恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合器，冰箱
四、 实验步骤
1. 取 1.5ml DH5 培养液倒入 1.5mL eppendof 管中,13000rpm 离心 1min 。

2. 重复1。

3. 弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。

4. 菌体沉淀重悬浮于100卩溶液I中（需剧烈振荡）,室温下放置10min。

5. 加入新配制的溶液n 200I,盖紧管口，快速温和颠倒eppendof管5次,以混匀内容物（千万不要振荡），
冰浴5min。

6. 加入150 1预冷的溶液川，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次,使沉淀混匀，冰浴中15分
钟,13000rpm 离心 5min。

7. 上清液移入干净eppendof管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24 : 1）,振荡混匀，13000rpm离心2min。

8. 将水相移入干净eppendof管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24 : 1）振荡混匀，13000rpm离心2min。

9. 将水相移入干净eppendof管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后，置于室温下 2min , 然后
13000rpm 离心 5min。

10. 弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1mL 70 %乙醇洗沉淀一次，振荡混
匀后，13000rpm离心 5min。

11. 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。

12. 将沉淀溶于30 1 LTE缓冲液（pH8.0,含20卩g/mL RNaseA中，保存在-20C冰箱中。

13. 按照同样的流程和方法将pET-28a的质粒也提出来，保存在 -20 C冰箱中。

五、实验结果。