现代医学研究方法进展

现代生物医学研究方法进展

1、How to examine protein transport from ER to Golgi ?

答：一个哺乳动物细胞含有近1万种、约1010个蛋白质分子。除了少数蛋白质在线粒体核糖体上合成外，绝大部分蛋白质是由细胞核DNA编码、并在细胞质基质的核糖体上合成的。蛋白质在胞质游离核糖体上起始合成后，转移到糙面内质网，新生肽边合成边进入糙面内质网腔中，经过一些加工如折叠，组装，加上一些糖基团等，才能成为较成熟的蛋白质。然后这些蛋白质被转移到高尔基体腔内，做进一步加工，整个过程中由线粒体共能，最终完成成熟的蛋白质。而有生命的细胞若是要正常运作，则必须将这些成熟蛋白质运送到细胞内的各个位置。

对蛋白质分选与运输感兴趣的研究工作者来说，能检测分析蛋白质从内质网转运到高尔基体加工的过程是非常兴奋的一件事。新合成的蛋白质离开内质网后，在运输他们到各自最终的位置之前都要先经过高尔基复合体进行一系列的加工。传统的方法已经证明蛋白质这种运输方式在生物化学上的必要性，并且确定了“运输中间体”的作用。目前，新的荧光标记蛋白技术使我们有可能追踪到活细胞中的单一运输中间体的整个生命过程，包括它们的形成，途径以及到达高尔基复合体中的速度。

有研究者在病毒糖蛋白ts045 VSVG上加上绿色荧光蛋白（GFP）标签，从而可以使蛋白质从内质网到高尔基体上的运输变得直观可视化。从包疹性口炎病毒突变株ts045获得的VSVG蛋白已经被广泛应用到膜运输的研究中，这主要是因为当温度达到40°时，VSVG在内质网发生可逆错折叠和滞留；而当温度降到32°时，它可以脱离内质网而进入高尔基复合体。实验结果显示把COS细胞40°培养时，融合蛋白VSVG-GFP基本都出现在内质网，而把温度降到32°培养15分钟，融合蛋白会重新定位，进入高尔基复合体。

而绿色荧光蛋白GFP连接在VSVG蛋白地胞质尾区，因此可以利用GFP的荧光，用共聚焦显微镜等高分辨率，并且可以看到荧光标签的显微镜来直接观察荧光的路径，速度以及荧光强度，从而可以直观看到蛋白质从内质网到高尔基体的运输过程。

利用荧光成像得到的结果显示，从内质网中输出来之后，VSVG-GFP开始集中形成很多不同形状，并快速形成一种前高尔基体的结构，它会向内改变位置沿着微管蛋白移向高尔基体。在前高尔基体结构转移大高尔基体复合物的过程中，没有任何的荧光信号的损失，并且他们迅速伸直变成一种管状的结构。

2、Of protein purification, could you please describe the fundamentals and applications of Ammonia Sulfate (AS), Ion Exchanger, Gel Filtration and Affinity Column through "glycophorin E, a dimeric transmembrane protein as an example.

答：蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。下面主要以血型糖蛋白E(glycophorin E)为例，简要介绍下几种蛋白纯化方法，包括硫酸铵（AS）法分级纯化蛋白、离子交换、凝胶过滤和亲和层析等。

硫酸铵（AS）沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。与盐溶刚好相反，

在蛋白质溶液中加入硫酸铵，会使得蛋白质的溶解度下降，因而沉淀出来。因为硫酸铵所解离的离子容很大，所带的电子数也多(NH4+, SO42-)，因此当其溶入水中时，会吸引大量水分子与这些离子水合，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。那么在纯化glycophorin E时，可以先使用不同浓度的硫酸铵如30%、40%、50%、60%、80%来沉淀目的蛋白，然后跑western blot或者测下其活性，检测蛋白在哪个浓度中量最大或者活性最强，这样就可以确实硫酸铵的最适浓度，达到最大纯化效果，初步纯化蛋白glycophorin E。

离子交换层析（Ion exchanger）技术是是一种建立在各种生物分子携带有不同的电荷的基础之上的分离方法，它依赖于分离系统的PH高于被分离物质的PI时，被分离物质带负电荷，可被阴离子交换剂结合，相反，则同阳离子交换剂结合。生物分子表面所带电荷即使有很小的差别，也足以采用离子交换层析技术把它们分离开来。蛋白质和酶都具有电解质性质，故可用离子交换剂进行分离提纯，特别是经过了初步纯化后的蛋白质和酶采用此法效果尤为显著。而glycophorin E在它的唾液酸中含有大量的负电荷，整个分子呈负电荷状态，在经过硫酸铵（AS）沉淀法初步纯化glycophorin E后，可以用阴离子交换剂如DEAE-纤维素进行进一步纯化。

凝胶过滤层析（Gel filtration）又称分子筛过滤、排阻层析等，是一种按分子量大小分离物质的方法。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。凝胶过滤层析的原理是把样品加到充满凝胶颗粒的层析柱中，用缓冲液洗脱。根据各组份的分子大小不同，在凝胶上受阻滞的程度不同。也就是蛋白质的大小不一，而凝胶上有大小不一的孔，大的蛋白质在凝胶中不进入孔内直接下来，速度最快，中等大小的进入大孔中，下来速度较慢，小的蛋白质则进入大小孔中，下来速度最慢，从而达到分离的目的。

亲和层析（affinity column）一种吸附层析，将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。其原理是利用抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。那么将与glycophorin E有高特异性结合的分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，让含有glycophorin E的蛋白混合液通过层析柱，则glycophorin E将会被吸附，而其他组分直接流出。然后用适当的缓冲液将glycophorin E 洗脱下来，这样就可以进一步地纯化该蛋白。

3、The computer-assisted search for distal enhancers described in Prof. Zhou’s lecture does not work well for those genes that emerged only recently in