定点突变技术

操作：设计引物，分别PCR，前两次PCR 反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后无需 纯化,直接将胶条切下置于EP管中, 80℃冷冻10min,然后将胶条离心后分 别取上清液作为模板进行第三次PCR,以 获得全长的突变目的基因
PCR介导的定点突变法其优点是操作较简 单，突变的成功率可达100%。但它亦 有两个缺点:①后续工作较复杂，PCR扩 增产物通常需要连接到载体分子上，然
寡核有酸引物介导的定点突变 法其优点是保真度比PCR突变法 高，经过改进后使该方法突变少 成功率大大提高，缺点是操作过 程环节复杂制。
盒式突变法具有简单易行、突变效率高 等优点，还可以在一对限制酶切位点内 一次突变多个位点。缺点是合成多条引 物的成本较高。另外，在一般情况下， 在靶DNA片段的两侧往往难以满足存在 一对限制性酶切位点的要求，限 制了该 方法的广泛应用。然而一旦具备了这样 的条件该方法则为首选。
定点突变技术
刘微
基因的定点突变技术
点突变的技术有很多种，常见的有： ㈠寡核苷酸介导的定点突变技术
（M13噬菌体法） ㈡ 盒式诱变 ㈢PCR点突变技术
1.引物PCR定点诱变法 2.重组PCR定点诱变法 3.重叠延伸PCR技术
寡核苷酸引物诱变技术 （M13噬菌体）
噬菌体M13的生活周期有二个阶段，在噬菌体 粒子中其基因组为单链，侵入宿主细胞以后， 通过复制以双链形式存在。将待研究的基因 插入载体M13，制得单链模板，人工合成一 段寡核苷酸（其中含一个或几个非配对碱基） 作为引物，合成相应的互补链，用T4连接酶 连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双 链分子在胞内分别复制，因此就得到两种类 型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。
重组PCR定点诱变2
操作：设计引物，分别PCR， 从两个PCR反 应管中各取出3μl PCR反应产物,混匀后用 CaCl2转化法转化至感受态大肠杆菌中。涂 平板后,从转化的细菌菌落中随机挑选若干,筛 选。
重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由 于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成 了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠 链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起 来.此技术利用PCR技术能够在体外进行有效 的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶 处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制 性内切酶消化的方法难以得到的产物.重叠延 伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设 计.
后才能对突变的基因进行转录、转译等 方面的研究;②T aqDNA聚合酶的保真 性偏低;因此，PCR方法产生的DNA片 段要经过核有酸序列测定，方可确证有 无发生其它突变。
谢谢
该方法常产生突变效率低的现象，其主
要原因是大肠杆菌中存在甲基介导的碱 基错配修复系统所致。针对这一问题， KUNKEL进行了改进，用尿嘧啶取代 DNA的选择作用提高了突变效率。