耐高糖酿酒酵母原生质体制备与再生过程研究

２ ｄ， 计算原生质体的形成率和再生率。 １．２．５ 原生质体最佳形成和再生条件 选定影响原生质体制备和再生的 ５ 个主要因素 ， 即 酶 浓 度 （ Ａ） 、 酶 解 时 间 （ Ｂ） 、 高 渗 缓 冲 液 （ Ｃ） 、 酶解温度 （ Ｄ） 和预处理剂 （ Ｅ ） 为优选 因 素 ， 每 个 因 素 取 ４ 个 水 平 进行 Ｌ１６（ ４） ５ 正交试验 ， 见表 １。
酵 母 膏 １ ％ ， 自 然 ｐＨ（ 为 ６．２ ～６．４） ； ＹＰＤ 固 体 培 养 基 ： 在 ＹＰＤ 液 体 培 养 基 中 加 入 ２ ％ 琼 脂 ； 再 生 高 渗 培 养 基 ： 在 ＹＰＤ 固 体 培 养 基 中 添 加 甘 露 醇 至 ０．８ ｍｏｌ／Ｌ 、 添 加山梨醇至 ０．８ ｍｏｌ／Ｌ、 添加 ＫＣｌ 至 ０．７ ｍｏｌ／Ｌ、 添加蔗糖 至 １７ ％ 。
柠 檬 酸 － 磷 酸 缓 冲 液 配 制 ： ０．１ ｍｏｌ／Ｌ 柠 檬 酸 溶 液
养基上 ， ３０ ℃ 倒置 培 养 ２ ｄ ， 可 见 菌 落 ， 计 菌 落 数 ， 得 出 原生质体的形成率和再生率［９］。 计算公式 ： 形成率（％）＝（Ａ－ Ｂ）／Ａ× １００ ％ 再生率（％）＝（Ｃ－ Ｂ）／ （Ａ－ Ｂ）× １００ ％
１．２ 方法 １．２．１ 生长曲线的测定
斜面活化菌种接于装有 １００ ｍＬＹＰＤ 液体培养基的
５００ ｍＬ 三角瓶中 ， ３０ ℃ ， １５０ ｒ／ｍｉｎ 振荡培养 ， 每 １ ｈ 取 样 ， 稀释 ５ 倍后测定 ＯＤ５００ 值。 １．２．２ 原生质体制备与再生 斜面活化菌种接种于装有 ３０ ｍＬＹＰＤ 液体培养基 的 １５０ ｍＬ 三角瓶中 ， ３０ ℃ ， １５０ ｒ／ｍｉｎ 振荡 培 养 至 对 数 中 期 ， 取 １．０ ｍＬ 发 酵 液 ３５００ ｒ／ｍｉｎ 离 心 ５ ｍｉｎ， 收 集 菌 体 ， 缓冲液洗 ２ 次 ， 无菌加入 １．０ ｍＬ ０．２ ％ β － 巯基乙醇 ， 在 ３０ ℃ 下 ， 静置处理 ２０ ｍｉｎ， 缓冲液洗 ３ 次 ， 离心收集 菌体 ， 加入 １．０ ｍＬ 水解酶 ， ３０ ℃ 恒温水浴反应 １．５ ｈ 后 ， ２０００ ｒ／ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ， ＫＣｌ 高渗缓冲液洗涤 ２ 次 ， 收集
基金项目 ： 辽宁省教育厅高校科研基金资助项目 （ＮＯ．２０２０７０１０９３） 。 收稿日期 ： ２００．１ 材料 １．１．１ 菌株
德 国 果 酒 酵 母 （ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ） ， 本 实 验 室保藏。
１．１．２
培养基 普通液体培养基 （ ＹＰＤ） ： 葡萄糖 ２ ％ ， 蛋白胨 ２ ％ ，
Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｒ ｅｐａｒ ａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒ ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒ ｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｒ ｏｍ Ｈｉｇｈ－ ｃｏｎｃｅｎｔｒ ａｔｉｏｎ Ｍａｓｈ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ＹＵ Ｚｈｉ－ｍｉｎ， ＬＵＡＮ Ｊｉｎｇ， ＸＵ Ｐｅｎｇ， ＷＡＮＧ Ｊｉ－ｈｕａ ａｎｄ ＺＨＡＯ Ｃｈａｎｇ－ｘｉｎ
原生质体［６～８］。 将原生质体用高渗缓冲液梯度稀释后取 ０．１ ｍＬ 稀 释为 １０－ ６ 倍的菌悬液涂布于再生高渗培养基上 （ 夹层法 培 养 ） ， ３０ ℃ 倒 置 培 养 ２ ｄ ， 可 见 到 原 生 质 体 的 再 生 菌 落 ， 计菌落数。
酿酒科技
２００８ 年第 ４ 期 （ 总第 １６６ 期 ）・ ＬＩＱＵＯＲ－ ＭＡＫＩＮＧ ＳＣＩＥＮＣＥ ＆ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２００８ Ｎｏ．４（Ｔｏｌ．１６６）
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耐高糖酿酒酵母原生质体制备与再生过程研究
俞志敏 ， 栾
摘 要：
静， 徐
鹏 ， 王继花 ， 赵长新
大连
（大连工业大学 辽宁省发酵工程重点实验室 ， 辽宁
蜗牛酶、 纤维素酶、 溶菌酶分别用相应的高渗缓冲 液配制 ， ０．２２ μ ｍ 微孔滤膜过滤除菌 ， 酶购自 ＳＩＧＭＡ 公 司。
１．２．４
酶系统的选择 运用 １．０ ％ 蜗牛酶、 １．０ ％ 溶菌酶、 １．０ ％ 纤维素酶和
０．５ ％ 蜗牛酶 ＋０．５ ％ 纤维素酶 ４ 个水解酶系对德国果酒
酵母进行原生质体化 ， 原生质体梯度稀释后菌悬液涂 布于蔗糖再生高渗 培 养 基 上 夹 层 培 养 ， ３０ ℃ 倒 置 培 养
作者简介 ：俞志敏 （ １９８２－ ） ， 男 ， 辽宁丹东人 ， 硕士研究生在读 ， 主要从事微生物育种工作。
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酿酒科技
２００８ 年第 ４ 期 （ 总第 １６６ 期 ）・ ＬＩＱＵＯＲ－ ＭＡＫＩＮＧ ＳＣＩＥＮＣＥ ＆ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２００８ Ｎｏ．４（Ｔｏｌ．１６６）
１．１．３ 试剂 １．１．３．１ 缓冲液
１１６０３４）
对 １ 株耐高糖酿酒酵母的原生质体制备和再生条件进行了研究。结果表明 ， 发酵 ７ ｈ 后为对数生长中
（ ５） 确 定 制 备 原 生 质 体 的 最 佳 条 件 为 蜗 牛 酶 浓 度 （ １．０ ％） 、 （ ０．７ ｍｏｌ／Ｌ） 、 酶 期 ， 适 宜 原 生 质 体 化 ； Ｌ１６ ＫＣｌ 高 渗 缓 冲 液 解时间 （ １．５ ｈ） 、 预处理剂 （ ０．１ ％ β （ ２６ ℃） ， 在 此 条 件 下 原 生 质 体 形 成 率 和 再 生 率 分 别 为 － 巯 基 乙 醇） 和 酶 解 温 度 （ ３９．７８ ％） 。 ８０．８４ ％和 ３６．０３ ％； 原生质体形成后在 ７ ％蔗糖高渗培养基上夹层培养再生率较高 关键词 ： 微生物 ； 耐高糖酿酒酵母 ； 原生质体 ； 制备 ； 再生 文章编号 ： １００１－ ９２８６ （ ２００８ ） ０４－ ００４５－ ０４ 中图分类号 ： ＴＳ２６１．１ ； ＴＱ９２５ ； ＴＳ２６２．２ 文献标识码 ： Ａ
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其中 ： Ａ—未去壁菌体用无菌水稀释后涂布于 —— ＹＰＤ 固体培养基 上生成的菌落数 ； —— Ｂ—原生质体用无菌水稀释后涂布于 ＹＰＤ 固体培养基上 生成的菌落数 ； —— 生 质 体 用 高 渗 缓 冲 液 稀 释 后 涂 布 于 高 渗 再 生 培 养 Ｃ—原 基上生成的菌落数。
３６．８５ ｍＬ， ０．２ ｍｏｌ／Ｌ 磷酸氢二钠溶液 ６３．１５ ｍＬ， ｐＨ６．０。 １．１．３．２ 预处理剂 ０．１ ％ β － 巯基乙醇 ： ０．１ ｍＬ β － 巯基乙醇用缓冲液定
随着不可再生能源石油资源的日益匮乏 ， 利用可再 生资源 （ 粮食或植物纤维素 ） 发酵生产酒精 ， 作为生物能 源代替或部分代替汽油被越来越多的关注
［１～２］
原生质体诱变或融合 ， 以得到符合用于浓醪发酵的酿酒 酵母 ， 探讨德国果酒酵母原生质体形成和再生的适宜条 件 ， 为其原生质体诱变育种或融合提供了前期的准备。
容到 １００ ｍＬ， 其中含 ０．１ ｍｏｌ／Ｌ 的 ＥＤＴＡ－ Ｎａ２； ０．２ ％ β － 巯基乙醇 ： ０．２ ｍＬ β － 巯基乙醇用缓冲液定容到 １００ ｍＬ；
ＤＴＴ： 内 含 １０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４、 ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ 二 硫 苏 糖 醇
（ ＤＴＴ ） 。
１．１．３．３ 高渗缓冲液 ＫＣｌ 高 渗 缓 冲 液 ： ｐＨ６．０ 的 柠 檬 酸 － 磷 酸 氢 二 钠 缓 冲 液 中 添 加 ＫＣｌ 至 ０．７ ｍｏｌ／Ｌ ； 甘 露 醇 高 渗 缓 冲 液 ： ｐＨ６．０ 的 柠 檬 酸 － 磷 酸 氢 二 钠 缓 冲 液 中 添 加 甘 露 醇 至 ０．８ ｍｏｌ／Ｌ ； 山 梨 醇 高 渗 缓 冲 液 ： ｐＨ６．０ 的 柠 檬 酸 － 磷 酸 氢 二 钠 缓 冲 液 中 添 加 山 梨 醇 至 ０．８ ｍｏｌ／Ｌ ， 蔗 糖 高 渗 缓 冲液 ： ｐＨ６．０ 的柠檬酸 － 磷 酸 氢 二 钠 缓 冲 液 中 添 加 山 梨 醇至 １７ ％。 以上培养基和试剂均于 １２１ ℃ 灭菌 ２０ ｍｉｎ 。 １．１．４ 酶液
， 因此 ， 如
何提高酒精的产量和生产效率是当前急需解决的问题。 目前 ， 酒精发酵生产大部分是间歇发酵 ， 其投资大、 设备 酒 利用率低［３］， 要解决这些问题就要进行酒精浓醪发酵。 精浓醪发酵具有设备利用率高、 蒸馏能耗少、 生产成本 低和酒精易处理等优点 ， 是一种具有较高应用价值的酒 精发酵技术［４］。 为实现酒精浓醪发酵 ， 首先要有能够耐高 浓度糖、 耐高温和耐高浓度酒精发酵菌株。德国果酒酵 母是本实验室保藏的一株耐高浓度糖酵母 ， 可以在糖浓 度为 ３０ ％ （ ｗ／ｖ） 时进行发酵。林秋叶等对其重要的生理 特征指标 ， 包括细胞形态、 降糖能力、 生殖曲线 ｐＨ 变化、 以及最终酒分进行了测定 ， 并对其生理特性进行了系统 的研究［５］， 但其并不耐高温和耐高浓度酒精 ， 还不能作为 浓醪发酵菌株。 笔者拟以德国果酒酵母为出发菌株进行
（Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄａｌｉａｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｄａｌｉａｎ， Ｌｉａｏｎｉｎｇ １１６０３４， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｒｏｍ ａ ｈｉｇｈ－ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｍａｓｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｉｍｅ ｆｏｒ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｔｈｅ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ７ ｈ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌｕｍ， ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｓｎａｉｌａｓｅ． Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｌ１６ （５）４ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ， ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｗｅｒｅ － ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ ａｎｄ ｈｙ－ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ： １．０ ％ ｏｆ ｓｎａｉｌａｓｅ， ０．７ｍｏｌ／Ｌ ｏｆ ＫＣｌ ｈｉｇｈ ｏｓｍｏｔｉｃ ｂｕｆｆｅｒ， １．５ ｈ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ， ０．１ ％ ｏｆ β ｄｒｏｌｙｓｉｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｔ ２６ ℃． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｗｅｒｅ ８０．８４ ％ ａｎｄ ３６．０３ ％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ａ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｈｉｇｈｅｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ （３９．７８ ％） ｏｆ Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｐｒｏ－ ｔｏｐｌａｓｔ ｗａｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ７ ％ ｓｕｃｒｏｓｅ ｍｅｄｉａ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｍｉｃｒｏｂｅ； ｈｉｇｈ－ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｍａｓｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ； ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ； ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ； ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ