实验一-碱裂解法提取质粒DNA

实验一、碱裂解法提取质粒DNA及检测

一、实验目的与原理简介

实验背景：质粒DNA的提取是基因工程操作中常用的基本技术。质粒作为载体应具备下列四个特点：

①有足够的容纳目的基因的幅度，并且对于携带的目的基因能够借助载体

的复制和调控系统得到忠实的复制与增殖。

②在非必要的DNA克隆区有多种限制性核酸内切酶的单一识别位点，易于

基因片段与载体的连接、重组与筛选。

③与宿主细胞有相同一个或多个遗传表型（如抗药性、营养缺陷型或显色

表型反应等）。

④拷贝数多，易于宿主细胞的DNA分开，便于分离提纯。

分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。

实验原理：碱裂解法质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。在强碱性pH时，染色体线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，调节pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性纠缠形成网状结构，经过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一直沉淀下来而被除去。

实验目的：提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。

二．实验试剂

1，SolⅠ100ml： 1M Tris-HCL（pH8.0）2.5ml，0.5M EDTA 2ml, DDW 91ml, 20%

葡萄糖4.5ml( 葡萄糖单独灭，灭完后加入Sol I中)，高压灭菌，4°保存。

2，SolⅡ100ml：（新鲜配制，常温使用）10% SDS 50ml， 2M NaOH 50ml。使用

前将两种溶液混合。

3，SolⅢ 500ml：KAc 147g， HAc57.5ml，加300mlDDW搅拌，定容至500ml。

高压灭菌，4°保存。

4，70%乙醇无菌水DDW

5，苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相

的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，

操作时应戴手套。

三、实验步骤

按1/100的比例接种保存的9K质粒大肠杆菌克隆菌种到3 mL的含有适当抗

生素LB培养基，37℃、180rpm培养过夜或培养12小时以上，活化菌种(至对数

生长期)。将活化的菌种按1/100接种至200 ml的LB培养基，37℃、250rpm剧

烈震荡培养过夜。

1、离心管（10mL）分装菌10ml，离心去上清（10000rpm，5min，4℃）；弃上清，

将离心管倒置于卫生纸上几分钟，使液体尽可能流尽。

2、重悬于800µl 冰冷的SolⅠ中；剧烈震荡重悬菌体。

3、加入1.6mL SolⅡ轻轻颠倒数次（动作要轻柔，防止断裂DNA形成碎片），彻底混匀，室温放置10min（SolⅡ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。

4、加入1.2mL冰冷的 SolⅢ立即轻轻颠倒完全彻底混匀，冰上放置10min。

5、4℃，12000rpm离心10min。SolⅢ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。

6、收集上清至新的离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀,沉淀核酸，室温放置大于10min。12000rpm离心5min，小心移出上清于一新离心管中。

7、加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置 2-5min，离心

12000rmp×10min。

8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次，12000rmp离心5 min。

9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。

10、将沉淀溶于50μl DDW中，储于-20℃冰箱中。

思考题：

1、加入酚/氯仿/异戊醇的作用？

2、沉淀DNA时为什么用无水乙醇？

实验结果：(请大家详细讨论自己组的实验结果)

A组：

B组：