感染性疾病的分子诊断

5'
3'
100-1000 RNA扩增子
5'
3'RNA
引物B
图8-3 原理示意图
5' 靶RNA
RT RNAseH
3' cDNA 5' RNA
3' cDNA
RT
引物B
3' cDNA模板
5'
引物A 5'
3'
5'
3'
5' cDNA
RNAseH
5'
3' RNA
3'
5' cDNA
()
• 的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温 度循环。整个反应过程由三种 酶控制，循环 次数少，忠实性高,其扩增效率高于，特异性 好。
端序列互补
3'
引物A
T7RNA聚合酶
5'
3'
100-1000 RNA扩增子
5'
3'RNA
引物B
图8-3 原理示意图
5' 靶RNA
RT RNAseH
3' cDNA 5' RNA
3' cDNA
RT
引物B
3' cDNA模板
5'
引物A 5'
3'
5'
3'
5' cDNA
RNAseH
5'
3' RNA
3'
5' cDNA
• 耐药性的检测 • 细菌的分型 • 流行病调查
第一节 病毒的基因检测
ห้องสมุดไป่ตู้
人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝
炎、脑炎、流行性感冒等等，占人类传染疾 病的75%左右。400多种不同病毒。
病毒结构：大 小：20-300
核心区：核酸（或）
外周衣壳：蛋白质
包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）
一、 乙型肝炎病毒
我国是高流行区，50%－70%的人受过感 染，8%－10%是携带者，肝炎患者中 60%是慢性肝炎患者，导致肝硬变，又与 原发性肝癌密切相关。
在肝细胞内的复制
传染性 病毒颗粒
传染性 病毒颗粒
部分双链 聚合酶 负链
A(n)
逆转录酶
包裹后的前 基因
包膜
肝细胞
（二）分子诊断
• 常用的免疫学检测方法，即二对半的检测存 在窗口期，不易早期诊断。
•1
• 采用普通、、竞争性、免疫杂交，可提供 直接、准确的病原学诊断证据。引物是根据S、 C、P、X基因中高度保守序列设计，决定扩 增的特异性和敏感度。
感染性疾病分子诊断标志物
• 病原体核酸分子（）
• 基因表达产物
• 代谢物
• 免疫应答分子
细
胞
T
免
疫
致敏T细胞
T
淋巴因子
体
IgM 感染早期出现
液 免
B
浆细胞
IgG 临近恢复期出现 IgA
疫
IgD IgE 与原虫和蠕虫感染有关
二、感染性疾病分子诊断 的常用方法
根据目的基因是否被放大， 可分为杂交法和扩增法。 信号放大技术检测方法
。
常规检测方法：
免疫学方法
微生物学方法
受敏感性、特异性限制，不易早期诊断， 并且不易提供病原体分型及耐药性方面的信 息。
感染性疾病的分子诊断策略
• 一般性策略（检出病原体）： • 判断有无感染 • 是何种病原体感染 • 常用方法： ＋ 杂交 • 完整性策略： • 检出病原体 • 分型（分类）－亚型－耐药性 • 常用方法：杂交、、基因芯片、测序
外壳（): 外壳蛋白成分为表面抗原
核心（)：
聚合酶
颗粒（完整的病毒）形态
HBsAg
（外膜蛋白）
HBcAg
（核衣壳蛋白）
HBV DNA
DNAPol
完整的乙肝病毒颗粒直径42纳米 由双层外壳和一个核心组成的，核心直径为27纳米， 内含双链和多聚酶
（一）病毒基因组结构
• 3.2双链病毒
• 不完全双连环状
• 长链L为负链：有4个开放阅读框S、C、P、 X
• S区编码外膜蛋白（）
• C区编码 、
• p区编码聚合酶
• X区位编码X蛋白，可能与病毒蛋白表
•
达有关。
2 1
3.2 C
X
基因组结构
S
P
1
1蛋白
2
2蛋白
S
C P X
基因分型
• 基因序列差异的多少，可将划分为不同的基因型，至今为 止已发现A、B、C、D、E、F、G、H共8种基因型：
()
• 的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温 度循环。整个反应过程由三种 酶控制，循环 次数少，忠实性高,其扩增效率高于，特异性 好。
引物A 5’端
5'
带有T7聚合
3'
酶结合位点，
5'
3’端碱基与 3'
靶 3’端序列
5'
互补;引物B的
碱基序列与 3’ 5'
端序列互补
3'
引物A
T7RNA聚合酶
靶分子数目不变，而检测的探针信号放大 采用多酶、多探针或二者结合等方法来增加探针标志 物的浓度使检测信号得到放大。 靶分子扩增技术检测方法 靶分子（、或探针）的扩增 、替代扩增、等
引物A 5’端
5'
带有T7聚合
3'
酶结合位点，
5'
3’端碱基与 3'
靶 3’端序列
5'
互补;引物B的
碱基序列与 3’ 5'
感染的慨念
感染是病原体和人体之间的相互作用过程 病原微生物：致病菌（条件致病菌）
共
生
微 生
状
物
态
人
体
微
生
物
不
人
同
体
的
感
染
状
态
在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生
感染性疾病：由某种病原体所致， 通过不同方式引起人体发生感染并 出现临床症状的疾病。
病原体：病毒、细菌、原虫、支原 体、衣原体、立克次体、螺旋体、 寄生虫
临床治疗病情缓解后一定时间内，在患者样 本中仍可以检测出相应的病原体。
有些病原体潜伏在进体内，没有临床症状。
4. 疾病状况的判断 检测出病原体的存在并不 能说此病原体就是引起疾病的直接原因。
该病原体可能是一种正常菌群
五、感染性疾病分子诊断 的临床应用及评价
• 用于感染性疾病治疗的监控和预测、病 情发展过程的危险性评价及疾病预后等。
三、感染性疾病分子诊断 的标本处理
• 标本采集处理主要包括选择合适的标本 种类、标本量、抗凝剂等及对标本进行 合适的传送、保存和预处理。
四、感染性疾病分子诊断 的结果解释
1. 阴性结果 假阴性可能性 方法的灵敏度太低 方法失败 目标分子
2. 阳性结果 假阳性可能性 方法的特异性 受到污染
3. 定性检测结果 有时不能提供病原体活力相 关信息
• A型主要存在于白人， • B型和C型主要存在于亚洲人群 • E型主要存在于西非 • F型仅见于中南美洲的土著人 • G型和H型很少见 • 不同基因型序列长度不同，主要是前S1区的不同。我国流
行的主要是B和C基因型，长江以北以C型为主，长江以南 以B型为主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南 尤其是西北有较高比例的D型
扩增位置 引物序列 扩增片断（)
P、X基因 5’3’
278
5’3’
C基因 5’3’ 477 5’3’
C基因 5’3’ 258 5’3’
有时为了证实扩增产物的特异性，对扩增产 物进行以下分析：
斑点杂交 杂交
2. 支链信号放大技术(）
• 原理: