多糖的分离纯化
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粗多糖用 2.5 L 纯化水复溶， 加入木瓜蛋白酶，63 ℃ 酶解 6 h，灭活过滤除去不溶物，滤液 进行第2 次酶解灭活脱蛋白。
滤膜过滤浓缩
再用微孔滤膜过滤，滤液用超滤膜 超滤浓缩至800mL 后加入无水乙醇 至 67% ， 4 ℃ 静置过夜后离心， 80% 乙醇洗涤 3 次，减压干燥。
01 02 聚酰胺层析
8 mm × 300 mm) 串联; 保护柱 TSKPWxl Guard column; Agilent 1260 示差折光检测器; 流
动相为纯化水; 体积流量0. 4 mL/min; 进样量 30μ L; 柱 温30 ℃ ; 检测器温度 35 ℃ ; 环境温度 25 ℃ 。 称取葡聚糖对照品、莼菜多糖各组分样品（BSP1、BSP2、BSP3），分别用纯水溶解并配 制成2mg/mL的溶液，过 0. 22 μ m微孔滤膜，取续滤液，将图谱数据导入 GPC软件，建立分 子量分布标准曲线，得到分子量对数 log MW与洗脱体积 VR的线性回归方程 log MW = 10. 513 － 0. 2377VＲ(r = 0. 996 2)，
滤液流经预处理的聚酰胺层
03 04 得到BSP
获得灰白色胶状莼菜多糖 (BSP) 22 g，收率为 8. 8% 。
析柱脱色，滤液与聚酰胺湿填
料的体积之比为1∶1，纯化水 洗脱，共收集洗脱液 8 L。
BSP含有量测定
01
葡萄糖标准曲线制作
利用蒽酮硫酸法： 以葡萄糖质量浓度为横坐 标 (X)，吸光度为纵坐标 (A)得曲线方程 A = 17. 294X －0. 0076 (Ｒ2 = 0. 9994)。
BSP 精制
洗脱曲线 (图 2) 表明， 莼菜精制多糖 BSP-1、 BSP-3 组分均一，分别 浓缩、冻干 。
对 2 个主要组分 BSP-1、BSP-3 用琼脂糖凝胶柱 Sepharose CL-6B 进一步的分离纯化，用纯化 水洗脱，蒽酮-硫酸显色法测定多糖含有量。
分子量测定 色谱条件: 色谱柱 TSK gel G5000PWxl ( 10 )、 G4000PWxl ( 10 )、G3000PWxl (7) (7.
02
BSP纯度测定
精密称取干燥至恒重的 BSP 24.72 mg 至 500mL
03
紫外检测
粗多糖经木瓜蛋白酶脱蛋 白、聚酰胺脱色素等处理 后，紫外全波长扫描显示 在 260、280 nm 处其吸 光度接近于零，表明已除 去蛋白质、核酸等杂质。
量瓶，纯化水溶解并定容，
摇匀，测定样品吸光度为 0.521，计算可知 BSP的
• 多糖在莼菜干品中所占的比例最高，主要分布于叶底部、
方法流程
采用碱提醇沉
再经DEAE纤 维素 DE-52 柱 Se p h a r o s e CL-6B 琼脂糖 凝 胶 柱 对 BS P 进行分级精制
采用高效凝 胶过滤色谱 (HPGFC)测 定 BSP 各组 分的分子量
工艺，经除蛋
白、除色素得 到莼菜多糖 (BSP)
纯度为 61. 89% 。
BSP 精制
BSP 经 DEAE 纤维素 DE52 分离后，可得 3 个峰 (图 1)，透析 (截留分子量 8 000 ～ 14 000)、浓缩、 冻干各峰组分，得到 BSP1、BSP-2、BSP-3。
取10 g BSP，200 mL 纯化水充分溶解后过DEDA 纤维素 DE-52 离子交换柱 (60 mm × 950 mm)， 依次用0～1.0mol/L NaCl 溶液梯度洗脱，分管收集洗脱液，采用 “2. 2” 项下方法，以洗脱管数 为横坐标，多糖浓度为纵坐标绘制洗脱曲线。
将莼菜多糖各组分导入 GPC 软 件，调用标准曲线，得出莼菜多糖 各组分的Mw、Mn 和 D 等， 结果见表 1，莼菜多糖的分子量 分布为 (1. 0507 ～ 1. 5208) × 106 Da，分子量较大。 图 3 显示，高效凝胶渗透色谱
图出峰时间单一，可知莼菜多糖各
组分均一性良好。
感谢在座各位聆听
莼菜多糖的分离纯化
汇报人：丁楚蔚
PPT制作：丁楚蔚、汪心妍 背景资料：谭晓菁、江淑华
研究背景
目录
实验步骤与结果 总结与展望
1
研
究
背
景
莼菜
• 睡莲科，多年生水生草本Байду номын сангаас物，又名马蹄草，
• 有调节免疫、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、降血糖、 降血脂等功效 ， • 含酸性多糖、多酚、蛋白质、氨基酸、维生素、组胺及 微量元素， 茎周围的黏液质中，是莼菜发挥药效的主要物质基础。
Sepharose CL-6B； 透析
袋；蒽酮、硫酸；纯化水
粗多糖的提取
除去脂溶性成分
取250g莼菜喷干粉，加无水乙醇 2.5 L，60 ℃ 旋转回流提取2 h，过滤， 重复操作 1 次，除去脂溶性成分，滤
渣烘干。
莼菜喷干粉
新鲜莼菜嫩叶，经清 水 淋 洗 、 均 浆机 剪 切 、 喷雾干燥得莼菜喷干粉 。
仪器与材料
仪器
Agilent 1200 HPLC 色谱仪 AE240 分析天平 UV-2102PC 紫外可见分光 光度计 FD-1C-55 冻干机 旋转蒸发仪 超滤仪 DZG-6020 减压干燥箱
材料
莼菜嫩叶；无水乙醇；
NaOH；盐酸；木瓜蛋白酶；
聚酰胺树脂； DEAE 纤维 素 DE-52；琼脂糖凝胶
莼菜粗多糖
加40倍 0. 3 mol/L NaOH 溶液，70 ℃ 加热搅拌提取 2 h，加盐酸中和，过滤，滤液 浓缩，加入无水乙醇至 67% ，4 ℃静置过夜， 4 500 r/min 离心 20 min，80% 乙醇洗涤 3 次，沉淀减压干燥，得 83 g 莼菜粗多糖。
粗多糖纯化
酶解灭活脱蛋白
滤膜过滤浓缩
再用微孔滤膜过滤，滤液用超滤膜 超滤浓缩至800mL 后加入无水乙醇 至 67% ， 4 ℃ 静置过夜后离心， 80% 乙醇洗涤 3 次，减压干燥。
01 02 聚酰胺层析
8 mm × 300 mm) 串联; 保护柱 TSKPWxl Guard column; Agilent 1260 示差折光检测器; 流
动相为纯化水; 体积流量0. 4 mL/min; 进样量 30μ L; 柱 温30 ℃ ; 检测器温度 35 ℃ ; 环境温度 25 ℃ 。 称取葡聚糖对照品、莼菜多糖各组分样品（BSP1、BSP2、BSP3），分别用纯水溶解并配 制成2mg/mL的溶液，过 0. 22 μ m微孔滤膜，取续滤液，将图谱数据导入 GPC软件，建立分 子量分布标准曲线，得到分子量对数 log MW与洗脱体积 VR的线性回归方程 log MW = 10. 513 － 0. 2377VＲ(r = 0. 996 2)，
滤液流经预处理的聚酰胺层
03 04 得到BSP
获得灰白色胶状莼菜多糖 (BSP) 22 g，收率为 8. 8% 。
析柱脱色，滤液与聚酰胺湿填
料的体积之比为1∶1，纯化水 洗脱，共收集洗脱液 8 L。
BSP含有量测定
01
葡萄糖标准曲线制作
利用蒽酮硫酸法： 以葡萄糖质量浓度为横坐 标 (X)，吸光度为纵坐标 (A)得曲线方程 A = 17. 294X －0. 0076 (Ｒ2 = 0. 9994)。
BSP 精制
洗脱曲线 (图 2) 表明， 莼菜精制多糖 BSP-1、 BSP-3 组分均一，分别 浓缩、冻干 。
对 2 个主要组分 BSP-1、BSP-3 用琼脂糖凝胶柱 Sepharose CL-6B 进一步的分离纯化，用纯化 水洗脱，蒽酮-硫酸显色法测定多糖含有量。
分子量测定 色谱条件: 色谱柱 TSK gel G5000PWxl ( 10 )、 G4000PWxl ( 10 )、G3000PWxl (7) (7.
02
BSP纯度测定
精密称取干燥至恒重的 BSP 24.72 mg 至 500mL
03
紫外检测
粗多糖经木瓜蛋白酶脱蛋 白、聚酰胺脱色素等处理 后，紫外全波长扫描显示 在 260、280 nm 处其吸 光度接近于零，表明已除 去蛋白质、核酸等杂质。
量瓶，纯化水溶解并定容，
摇匀，测定样品吸光度为 0.521，计算可知 BSP的
• 多糖在莼菜干品中所占的比例最高，主要分布于叶底部、
方法流程
采用碱提醇沉
再经DEAE纤 维素 DE-52 柱 Se p h a r o s e CL-6B 琼脂糖 凝 胶 柱 对 BS P 进行分级精制
采用高效凝 胶过滤色谱 (HPGFC)测 定 BSP 各组 分的分子量
工艺，经除蛋
白、除色素得 到莼菜多糖 (BSP)
纯度为 61. 89% 。
BSP 精制
BSP 经 DEAE 纤维素 DE52 分离后，可得 3 个峰 (图 1)，透析 (截留分子量 8 000 ～ 14 000)、浓缩、 冻干各峰组分，得到 BSP1、BSP-2、BSP-3。
取10 g BSP，200 mL 纯化水充分溶解后过DEDA 纤维素 DE-52 离子交换柱 (60 mm × 950 mm)， 依次用0～1.0mol/L NaCl 溶液梯度洗脱，分管收集洗脱液，采用 “2. 2” 项下方法，以洗脱管数 为横坐标，多糖浓度为纵坐标绘制洗脱曲线。
将莼菜多糖各组分导入 GPC 软 件，调用标准曲线，得出莼菜多糖 各组分的Mw、Mn 和 D 等， 结果见表 1，莼菜多糖的分子量 分布为 (1. 0507 ～ 1. 5208) × 106 Da，分子量较大。 图 3 显示，高效凝胶渗透色谱
图出峰时间单一，可知莼菜多糖各
组分均一性良好。
感谢在座各位聆听
莼菜多糖的分离纯化
汇报人：丁楚蔚
PPT制作：丁楚蔚、汪心妍 背景资料：谭晓菁、江淑华
研究背景
目录
实验步骤与结果 总结与展望
1
研
究
背
景
莼菜
• 睡莲科，多年生水生草本Байду номын сангаас物，又名马蹄草，
• 有调节免疫、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、降血糖、 降血脂等功效 ， • 含酸性多糖、多酚、蛋白质、氨基酸、维生素、组胺及 微量元素， 茎周围的黏液质中，是莼菜发挥药效的主要物质基础。
Sepharose CL-6B； 透析
袋；蒽酮、硫酸；纯化水
粗多糖的提取
除去脂溶性成分
取250g莼菜喷干粉，加无水乙醇 2.5 L，60 ℃ 旋转回流提取2 h，过滤， 重复操作 1 次，除去脂溶性成分，滤
渣烘干。
莼菜喷干粉
新鲜莼菜嫩叶，经清 水 淋 洗 、 均 浆机 剪 切 、 喷雾干燥得莼菜喷干粉 。
仪器与材料
仪器
Agilent 1200 HPLC 色谱仪 AE240 分析天平 UV-2102PC 紫外可见分光 光度计 FD-1C-55 冻干机 旋转蒸发仪 超滤仪 DZG-6020 减压干燥箱
材料
莼菜嫩叶；无水乙醇；
NaOH；盐酸；木瓜蛋白酶；
聚酰胺树脂； DEAE 纤维 素 DE-52；琼脂糖凝胶
莼菜粗多糖
加40倍 0. 3 mol/L NaOH 溶液，70 ℃ 加热搅拌提取 2 h，加盐酸中和，过滤，滤液 浓缩，加入无水乙醇至 67% ，4 ℃静置过夜， 4 500 r/min 离心 20 min，80% 乙醇洗涤 3 次，沉淀减压干燥，得 83 g 莼菜粗多糖。
粗多糖纯化
酶解灭活脱蛋白