ch6细胞工程教案

第六章植物细胞培养与次生产物生产

（4学时）

教学目的与要求：

深入了解植物细胞在离体条件下的生长特性，掌握植物细胞悬浮系的建立以及种细胞的筛选方法。

第一节、悬浮培养(suspension culture)

悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。

悬浮培养与固体培养比较有三个优点：一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；三是振荡培养可以适当改善气体的交换。

一、愈伤组织的诱导与起始培养物的建立

●选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。

●选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度；必要的附加物质。

●愈伤组织的要求：松散性好、增殖快、再生能力强

二、悬浮系的建立与继代培养

一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：

● 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培

养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。

● 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，

培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。

● 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。

三．悬浮细胞的生长动态

影响悬浮细胞生长的因素：

●起始愈伤组织的质量

●接种细胞密度

●培养条件：方式、温度、

●继代周期

四、悬浮培养细胞的同步化

细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。

●植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚并进入不同程度的分化状态，因

此，要达到完全同步化对于植物细胞培养来讲是十分困难的。

●也正是因为同一培养体系的植物细胞通常并不能处于同一细胞周期，这种差异使

悬浮细胞的分裂、代谢以及生理生化状态等更趋复杂化。

●通过一定的理化措施可以使同一体系中的细胞达到相对同步化。

细胞同步化的常用方法：

●饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿

而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期，当在培养基中加入所缺乏的成分或者将

饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，则细胞分裂又可重新恢复。

●抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，

当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期－G1期的同步化细胞。

●分选法：通过细胞体积大小分级将处于相同周期的细胞进行分选，将同一周期的

细胞继代培养于同一体系中，使相同培养体系中的细胞具有较好的一致性。

●低温处理：冷处理也可以提高培养体系中细胞同步化的程度。Okamura等曾采用

此途径使胡萝卜悬浮细胞较好的同步化。梅兴国等（2001）采用6 ℃低温处理

红豆杉细胞也获得较明显得同步化效果。

第二节、植物细胞的规模培养

一、概述

在植物生物技术中，应用培养细胞系统合成有用的天然产物，很可能发展成为一个广义的化学工业的一个组成部分。长期以来，植物一直是许多化学品的主要资源，特别在制药和食品加工业中更是不可缺少。据不完全统计，至少有20％左右的药物是由植物衍生而来的，而且每年都可发现许多植物来源的新化合物。

植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。

李时珍（1593）在《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。

许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。

规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径

●保护生态环境

●提高生产效率

●发展新型生物技术产业

来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较

Examples of enhancement in natural product yield in selected cell lines compare with

植物次生代谢产品的市场潜能

Stages in the development and operation of a plant cell biotechnology process

植物细胞大规模培养的技术要求：

从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统；

从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物；细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的

Biomass and/or medium

Product extraction

Product Callus

Or

Suspension Culture established

终产物；代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。

二、植物细胞规模化培养体系的建立

1、细胞系的建立和选择

2、优良细胞系的增殖培养

3、大规模培养体系的建立

培养方式的选择：

●间歇培养－流加间歇培养

两级或多级间歇培养

●连续培养－单级连续培养

多级连续培养

回流式连续培养

●固定化细胞培养

单细胞克隆技术—细胞平板培养

●平板培养（plating culture）是指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基

中进行培养的技术。

三、生物反应器类型及其特点

1、悬浮培养系统

液体悬浮培养系统基本原理与上述实验室悬浮培养方法一致，但大规模培养所采用的设备及控制技术比实验室小规模培养要复杂的多。

●机械搅拌式培养系统

机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；为便于取样观察，一般还设计有取样口。

●气压搅拌式培养系统

考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易