绿色荧光蛋白

知识介绍
绿色荧光蛋白
马金石
(中国科学院化学研究所 北京 100190)
摘 要 绿色荧光蛋白是46多年前从多管水母体内发现的,它可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光。

由于它稳定的结构和光物理性质,又易于在细胞内表达,近些年作为标记物已经被广泛地应用于生命科学领
域。

本文简要介绍了水母发光蛋白与绿色荧光蛋白的关系、绿色荧光蛋白的结构、发色团的形成、发光机制、变异体以及它的特点和应用。

关键词 绿色荧光蛋白 基因表达 结构 发色团 生物发光
Green Fluorescent Protein
Ma Jinshi
(Insti tute of Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing100190)
Abstract Green fluorescent protein(GFP)was discovered46years ago from A equorea V ictoria,it can emit green light under exci tation of blue or UV irradiation.GFP as a marker for gene expression and localization of gene products has been
widely used in life sciences for the past years because of its stable structure and photophysical property and easy expression
in cells.A brief introduction on the relationship of aequorin and GFP,GFP structure,chromophore formation,and the mechanism of bioluminescence,also the variants,characteri stic and application are presented in this paper.
Keywords Green fluorescent protein,Gene expression,Structure,Chromophore,Bioluminescence
由于对绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的发现、机理研究以及利用做出的特殊贡献,瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将2008年度诺贝尔化学奖授予美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、马丁 沙尔菲(Martin Chalfie)和美籍华裔化学家钱永健(Roger Y Tsien)。

化学奖评选委员会主席贡纳尔 冯 海伊内和评委莫恩斯 艾伦贝里对绿色荧光蛋白的评价指出,这是当代生物学的重要工具,借助这一 指路标 ,科学家们已经研究出监控脑神经细胞生长过程的方法,这在以前是不可能实现的。

他们说,下村修1962年在北美西海岸的水母中首次发现了一种在紫外线下发出绿色荧光的蛋白质,即GFP。

随后,马丁 沙尔菲在利用GFP做生物示踪分子方面做出了贡献;钱永健让科学界更全面地理解GFP的发光机理,对GFP作了改造,通过改变其氨基酸排序合成出了能吸收、发射不同颜色(蓝色、蓝绿色和黄色)光的荧光蛋白,为同时追踪多种生物细胞变化的研究奠定了基础。

我国在生命科学领域已经广泛应用GFP,对它的介绍和应用的文章也有很多[1~6]。

国外的综述可阅读钱永健和Zimmer的文章,最新的是Shaner等的文章[7~9]。

化学界对它的了解可能较少,在此做个简单介绍。

1 生物发光与水母
先从生物发光说起,生物体的发光现象称为生物发光。

植物界有细菌植物门的发光细菌和真菌植物门的发光蘑菇,动物界从原生动物到脊椎动物都有,脊椎动物中主要是鱼类。

从发光生物的分布来
2008 10 25收稿,2008 11 04接受
看,海产多,陆地上见得最多的是萤火虫。

深海中太阳光照射不到,一片黑暗,自身发光是彼此传递信息的唯一来源。

深海中缺乏海洋植物,无海藻可吃,要维持生命就靠 大鱼吃小鱼 , 弱肉强食 养活自己。

因此自身发光的作用就显得非常重要。

1885~1887年,Dubios首先从磕头虫(Click bettle,Pyrophorus)和蛤(Clam,Pholas dactylus)中发现了对热稳定的荧光素(luciferin)和对热不稳定的荧光素酶(luciferase)。

荧光素是一种小分子有机化合物,生物发光过程就是荧光素在荧光酶存在条件下被氧化成处于激发态的氧化荧光素(oxyluciferin),激发态回到基态时就发出光和得到氧化荧光素。

荧光素+O2(或H2O2)荧光酶
[激发态氧化荧光素]*
氧化荧光素+光
不同的发光生物具有不同的荧光素和荧光素酶。

生物发光是将化学能转化为光能,可以认为是一种化学发光。

陆产和淡水产的发黄绿-橙黄色光,海产的一般发蓝光,由于蓝色光比其他颜色传播得更远,在水中容易被感知,因此是海洋生物发光的首选。

海洋生物中,对腔肠动物(coelenterate)中的软体珊瑚虫海肾或称海三色紫罗兰(Sea Pansy Renilla reniformis)、水母纲的多管水母Aequorea victorin研究得比较多。

水母的整体或分离出的颗粒是发绿光的。

科学家首先从多管水
母身上分离出了水母发光蛋白(aequo rin),其分子量为20kDa,它在遇
钙离子以后发射波长460~470nm的蓝光。

每只水母平均只含50 g
的这种物质。

aequorin是水母荧光素(coelenteragine,结构如右)通过
硫酸酯键或过氧化键紧紧地连到脱辅水母发光蛋白(apoaequorin)上
形成的,它遇到钙离子就发蓝光,因此可以用它作为钙离子的检测试
剂,发光后的产物是脱辅水母发光蛋白,C O2和氧化荧光素(colentera mide),见图式1。

与其他发光生物不同的是,aequorin发出的蓝光,通过F rster共振能量转移将能量传给水母体内的GFP,发出波长509nm 的绿光,所以水母在整体发光时发绿光。

图式1 水母发光蛋白的组成和发光过程
Scheme1 Composition and bioluminescence of aequor in
关于发光生物(包括水母)荧光素的发光机理在此不作更详细介绍,有兴趣者可阅笔作者在 生物有机光化学 一书中的介绍和其他文献[1]。

2 绿色荧光蛋白(GFP)
2 1 GFP的结构
下村修等1962年首先从太平洋多管水母(图1)中分离出来了GFP[10]。

它是一种天然的纳米粒子(图2),大约8~10nm,呈圆筒形折叠。

在晶体中或在离子强度低于100mmol L的溶液中两个原体形成二聚体。

二聚对于GFP的激发光谱和能量传递是有作用的。

为了有效地传递能量,二聚体和水母发光
蛋白有生理相互作用[11,12]。

图1 维多利亚多管水母
Fig.1 Aequorea victorin
图2 绿色荧光蛋白
Fig.2 G reen fluorescent protein(GFP)图3 GFP 折叠布局[14]Fig.3 The topology of the GFP fold ing pattern [14]
圆筒外边11条链形成结构的外壁。

圆筒直径3nm 长4nm 。

螺旋小的片段在圆筒的末端形成筒,一个不规测的 螺旋片段作为一个支架可以提供给发色团,使其坐落在圆筒的中心。

片层状的链彼此牢牢地固定,像支撑桶的棒。

结构形成一个密集体,没有开口。

这种折叠的模式是 片层状在外, 螺旋在内,是一种新的蛋白类型,命名为 罐(beta can )[11~13]。

图3给出了GFP 折叠的布局。

从C 末端除去多于7个的氨基酸或者从N 末端除去带蛋氨酸的片段就没荧光了,没荧光的变异就不会表现出整个发色团的吸收光谱特征。

最后的7个残基无序,在圆筒的外边弯回来,不构成筒的外壁,它们的存在不是必需的,另外再加一些残基也没关系。

至于N 末端,在圆筒内的第一条蛋白链开始于残基10,筒的形成不需要N 末端部分。

N 末端片断是在蛋白的一头的帽子的主要成分,是折叠的,可以保护发色团。

在N 末端延伸不会破坏蛋白的结构。

非常紧密牢固的筒状结构和发色团所处的中心位置,都可以说明发色团被严格保护,性质稳定。

荧光不会由于和氧的相互碰撞而被猝灭,使得量子产率降低。

由于结构的关系通过系间窜越形成单重态氧而遭光化学损伤的几率也降低了。

GFP 由238个氨基酸组成,分子量约28kDa,组成发色团蛋白的3个残基Ser dehydroTyr Gly(丝 脱氢酪 甘)位于65~67位,经共价键连接而成对羟苯甲基咪唑烷酮,它可以被光激发产生荧光(图式2)。

野生水母GFP 的最大吸收 激发波长在395nm,一个小峰在475nm,摩尔消光系数分别为30000和7000mol -1c m -1,发射峰在509nm(图4)[15~20],GFP 晶体的荧光光谱和GFP 水溶液的荧光光谱基本相同。

虽然氨基酸序列Ser dehydro Tyr Gly 在不少蛋白中也存在,但不是环化的,酪氨酸也不是被氧化的,更不会发光。

说明能形成发色团不是这三肽的固有特性。

在GFP 中,发色团的形成经系列自催化过程,既无辅助因子也没有酶介入。

首先是Ser65和Gly67快速环化形成咪唑啉 5 酮中间体,然后O 2慢慢氧化Tyr66的
图式2 G FP 发色团的分子结构
S cheme 2 T he molecular structure of GFP chromophore
图4 GFP 的吸收 激发和发射光谱[19]
Fig.4 Abs orption excitation and emission spectra of GFP [19]
侧链,这个过程要几个小时(图式3)。

形成发色团需要Gly67,没有任何一个氨基酸可以取代Gly 。

反应对热敏感,温度高于30 时产率下降。

一旦形成GFP,它就是热稳定的。

图式3 形成发色团的生物合成过程
Scheme 3 Biosynthetic scheme for the chromophore
GFP 的发色团很稳定,用酸、碱、盐酸胍使蛋白变性,一旦恢复中性或除去变性剂,又可以恢复发光性能。

2 2 GFP 发光机制
水母发光蛋白发出的蓝光通过能量转移激发GFP 发出绿光,见图5。

水母发光蛋白
Ca 2+脱辅水母发光蛋白+氧化荧光素+蓝光绿色荧光蛋白蓝光绿光
图5 水母发光蛋白由于钙离子的激活,发射蓝光(470nm),被GFP 吸收发射绿光(509nm)[21]
Fig.5 Aequorin is activated by Ca 2+,emitting b lue light(470nm).In vivo an energy trans fer from the excited state of
the coelenteram ide to G FP,emitting the green fluorescence(509nm)
[21]
图6 能量传递过程的F rster 循环Fig.6 F rster cycle within the core of a protein 水母发光蛋白上连接着荧光素,遇钙离子
后发蓝光,经共振能量传递诱发GFP 发光,整
个过程形成F rster 循环,GFP 是第一个知道的
在蛋白核心的F rster 循环的例子[11,12]。

GFP 激
发态的动力学用稳态和时间分辨荧光光谱进行
过研究,结果认为,质子转移包含在两个基态和
两个激发态的相互转换中。

围绕发色团的极性
相互作用可以适应质子的重排。

在循环中根据
Tyr66是处于羟基形式(上左)或它的酚盐形式
(下左),荧光色团分别吸收395nm 或470nm 的
光。

酚在激发态比在基态具有更强的酸性,可以认为,荧光色团质子化的激发形式(上右)转换成激发的酚盐(下右),它是仅有的发光物种,可以发射509nm 的光。

在这个循环中荧光色团吸收一个光子,失去一个质子,发射一个光子,得到一个质子,回到原来的状态(图6)。

关于详细机制的描述,见综述文献[5,9]。

2 3 变异的GFP
1992年,根据GFP 的氨基酸序列,合成了相应的寡核苷酸片段,利用转基因技术,从A .Victoria 的反转录DNA(cDNA)文库中筛选出几个GFP 的阳性克隆,再和质粒结合,利用转基因动物的启动子病原启动子作为表达启动子,和所要研究的蛋白的基因结合,该基因在如大肠杆菌、线虫、酵母、果蝇、昆虫细胞等异源细胞内表达也能发出绿色荧光。

沙尔菲等首先拿到GFP 的基因,对实现GFP 的基因表达做出了突出的贡献[19,22]。

其后GFP 作为活细胞分子探针,在基因表达调控、转基因动物研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化、病原菌侵入活细胞的分子过程等研究方面表现出极大的用途。

如果改变GFP 的基因,就可以得到变异的GFP,发光颜色和强度都会变化,有些基因变异的GFP 的荧光还很强。

钱永健等在这一领域做出了突出贡献[23]。

图7中表示的是几个变异GFP[蓝FP(BlueFP)、青FP(CyanFP)、绿FP(GreenFP)和黄FP(YellowFP)]的归一激发和发射谱。

发色团周围的环境可以解释GFP 现有变种的荧光和行为。

在口袋里的大部分极性的残基在Tyr66边上形成一个氢键的网,在Thr203,Glu222和Ile167的侧链上的原子通过范德华力和Tyr66连接。

这些残基的变化对发色团会产生直接的立体效应,如果电荷也有变化,变种就会改变静电环境。

在接近发色团的位置的残基发生变异就会直接影响吸收和发射光谱。

变异使得波长位移,荧光强度发生变化,当变异体使得激发波长可以移至490nm 附近时,就可以与荧光激活细胞分选器仪(FAC S)和激光扫描共聚焦显微镜的氩离子激光器的激发波长488nm 相匹配,使激发效率大大高于野生GFP 。

如Phe64被Leu 取代,Ser65被Thr 取代的EGFP 荧光强度就增加了35倍。

下面列举一些变异体的例子[7,13,23~25]:(1)发色团的Tyr66变为Phe,激发谱带会位移,强度大大减弱;(2)Ser65变成The,增加荧光强度,增加的原因可能是降低了由于相互碰撞引起的猝灭。

另外甲基使得蛋白内部堆积的更好了;(3)Tyr66变成His,激发
最大值移至紫外区383nm,发射蓝光在448nm;(4)Tyr66到Trp的变异,荧光发生蓝移,和野生的GFP相比,强度减弱;(5)改变Ser65为Thr、Ala、Cys或Leu,可以失去395nm激发峰,而使蓝色激发增强;(6)结合Ser65的变异,同时变异接近发色团的位点,如将Val68变成Leu和变Ser72为Ala,会增加在488nm处激发而产生绿色荧光;(7)变Ser202成Phe和变Thr203成Ile都可以失去在475nm处的激发,而保留395nm 的激发;(8)变Ile167为The,可以使395对475nm强度比反转;(9)Glu222变成Gly,就没有了395nm的激发;(10)变Val163为Arg,可以增加Ser65变为Thr的变异的变化,还可减少温度对功能化GFP表达的影响;(11)His148的变异影响激发在395nm和475nm对pH的依赖性。

His的N原子到发色团Tyr66的羟基的距离是0 33nm;(12)变Phe100成Ser,Met154成Thr和变Val164成Ala的变异从结构上讲很难解释。

154和164的位置在蛋白的表面。

这些变异引起的变化可能是由于改变溶解性和降低聚集。

Phe Ser的变异可能使蛋白的核心不稳定,尚不清楚如何使整个系统改进。

图7 变异GFP(BlueFP,CyanFP,GreenFP和YellowFP)的归一激发和发射谱[24]
Fig.7 The corrected excitation and emission spectra of GFP and some of its variants(termed as BlueFP,CyanFP,
G reenFP and YellowFP variants)[24]
2008年的一项最新研究成果是美 俄科学家将GFP变异形成一个红色发色团,虽然应用于细胞标记的源于其他生物体的红色发光蛋白已经有了,但在任何生物体内很容易进行表达且能形成一个红色GFP的意义重大。

他们发现经过多次GFP表达细菌的任意变异的循环和大量的筛选,才得到红色的GFP变异。

这个很亮的红色荧光变异体的结构如图8所示,读者可以看到,在结构上它多了一个双键,使它发红光和绿光[20]。

图8 红色荧光变异体的三维结构模型(左)和分子结构(右)[20]
Fig.8 Three dimens ional structure of GFP mutant(left)and molecular s tructure(right)[20]
分子生物学和细胞生物学的标记物、基因的表达、蛋白的定位和变化需要用荧光标记。

传统的方法
之一,是将纯化的蛋白和荧光染料通过有机合成共价结合,但化学计量和染料的结合部位难以控制,纯化也很麻烦,另外还要想法让结合了染料的蛋白通过细胞膜进入活细胞;方法之二,是用分子生物学的方法产生荧光蛋白,如可以用萤火虫和细菌的荧光素酶基因产生荧光蛋白,但活体内没有荧光素和其他所需要的底物,因此难以在活体内使用。

GFP本身和这些变异为GFP在生命科学的各个领域的应用打下了很好的基础,可很方便地实现不同颜色的双标记、多标记。

在荧光标记技术上可以说有了飞跃式地发展和革命性的变化[1~7]。

2 4 GFP的特点
利用GFP的优点很多[3,4]:(1)它不仅本身稳定,不需要任何反应底物和辅助因子,且无种属限制,可在多种生物细胞中表达发出稳定荧光,不容易被猝灭。

在450~490nm蓝光激发下,发光能保持10min 以上。

甲醛固定后发光性质也没有改变;(2)分子量小,对细胞没有毒性。

对一系列与GFP的N段或C 段融合的蛋白的研究表明,融合蛋白具有与GFP一样的荧光性质。

由于GFP的分子量小,对目的基因的功能无任何影响,因此可以连续传代培养;(3)使用方便,可对活细胞进行观察。

用基因枪转化的受体细胞组织的瞬间表达或整株植物都可以用手提紫外灯观察。

利用激光扫描共聚焦显微镜,甚至普通显微镜都可以观察到活细胞内蛋白的变化、活动。

得到的数据经过处理可以进行三维显示;(4)变异细胞可显著改变荧光特性。

通过生物化学的方法将基因做小小的改变,就可以改变GFP中的氨基酸,得到变异GFP。

如将65位的Ser变成The的GFP(S65T),吸收光谱发生红移,用蓝光激发后发光强度比原来的增加6倍。

另一个突变型GFP(Y66H Y145F),发光蓝移,在紫外光激发下发蓝光。

这样就可以利用发光不同的GFP对同一个细胞内的不同蛋白进行标记。

变异蛋白的吸收光谱可以从395nm移至480~ 501nm,发射光谱基本不变,而发光强度增加100倍。

2 5 GFP的应用
通常天然的GFP在细胞内几个小时就可以形成发色团,在大肠杆菌中需要1~2小时才发光,而有的突变蛋白8min就能观察到发光,使用起来很方便。

通过转基因技术可以把它连接到一种病毒上,然后,随着病毒在宿主体内不断扩散,就可以通过跟踪发出的绿光来观察病毒的扩散途径,或者把它接合到一种蛋白质上并通过显微镜观察它在细胞内部的移动。

因此在生命科学的各个领域得到广泛的应用[2]:(1)研究基因表达的调控元件和蛋白定位;(2)研究基因表达的时序控制与空间定位;(3)发育分子机理研究,GFP可以作为活体标记,在原位观察细胞的生长和运动。

特别对于身体透明的动物观察起来更方便;(4)筛选药物,由于可以用不同颜色的GFP衍生物标记相关的蛋白来观察单细胞内相互作用的靶蛋白,再分离出目的细胞,从而可用于大规模药物筛选;(5)临床检验,生产出GFP标记的抗原或抗体,就可以免疫诊断;(6)转基因动物和植物的筛选标记,微生物在体内的感染途径,病毒和宿主的相互作用等,如将其插入动物、细菌或细胞的遗传信息中,随着细胞复制,可观察不断长大的癌症肿瘤、细菌的生长等等。

GFP的用途已经扩展到艺术和商务领域,艺术家把GFP插入兔子细胞内创造出了一只荧光的绿色兔子。

育种工作者利用GFP来创造特殊的荧光植物、花卉和各种鱼类,GFP已经被移植到大鼠、老鼠、青蛙、有翅昆虫、蠕虫以及不计其数的其它生物体内。

斑马鱼是一种常见的观赏鱼,它身上的条纹通常是黑白相间的。

新加坡国立大学的科学家创造出的荧光斑马鱼,在紫外线照射下,能够发出绿光或红光。

如果给基因加上一个 开关 ,在遇到重金属、毒素、激素时, 打开 发光蛋白的基因,让斑马鱼立即发出特殊的荧光,就可以用于检测污染的水域。

另一种比较著名的转基因荧光动物是荧光猪,东北农业大学克隆出3头口、蹄及舌头呈现出绿色荧光的转基因小猪。

在紫外线的照射下,荧光猪的没有被毛发遮盖的部位发出了荧光。

科学家将给实验植物插入各种 信使基因 。

这些基因将在恶劣的火星环境下发出一种绿色的荧光。

每种 信使基因 只对一种特定的不利环境因素(干旱、疾病、温度等)作出反应。

现在科学家们还在继续寻找新的荧光蛋白基因,基因表达的蛋白不仅可以发绿光、黄光、橙光,还可以发红光,用于多色荧光标记和荧光共振能量传递。

众多的荧光蛋白基因的发现,以及基因表达技术的进步,必会在生命科学的各个领域大放异彩。

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马金石
1940年生于天津
1965年毕业于北京大学化学系有机合成专业
现系中国科学院化学研究所研究员
近年来从事超分子化学、生物有机光化学和有机合成研究
E mail:js ma@。