第六章 常用分子生物学技术的原理及应用

(2)逆转录法合成cDNA第一、二条链
三、基因组 DNA文库
目录
四、 染色体步移
五、 消减杂交
是以不同个体或不同细胞来源的基因组片段（包括mRNA-cDNA、 cDNA-cDNA、DNA-DNA）之间，在一定条件下变性、复性。一旦某 一个体细胞缺失了某一DNA片段或某mRNA不正常表达，在与正常来 源的DNA片段或正常表达mRNA的cDNA进行DNA-DNA，cDNA-mRNA或
（7）1953年，Watson和Crick提出了DNA结构的 双螺旋模型，揭示了遗传物质自我复制的机制。 （8）1961年至1966年，Nirenberg和Crick 等人 破译了DNA遗传密码，1966年 破译了64个遗传 密码。 提出了遗传信息由DNA → RNA→蛋白质传递 的中心法则。 （9）1969年，Jonathan Beckwith及其同事在哈 佛大学成功分离出第一个基因。
1950年，Astbury在一次学术报告中，首 次提出并使用了分子生物学这一名词术语。
医学分子生物学是应用分子生物学技术和 理论来阐明人体正常生理活动和病理过程 及其调控的分子机理的一门科学。
一、分子生物学一些重要的理论知识
1.分子生物学发展史上一些重要的事件
（1）1865年，“遗传学之父”G.Mendel根据 豌豆杂交试验结果，创立了遗传因子学说，即 遗传的分离律和自由组合律。 （2）1903年W.Sutton提出染色体是Mendel遗 传单位的载体的概念。 （3）1909年，W.Johannsen将这种在染色体 上的遗传单位定名为基因（gene）。
cDNA-DNA杂交时，未缺失的特定DNA片段或正常表达的mRNA逆转录
而合成的cDNA片段就会因没有与其同源的互补顺序而不形成杂交 体，从而出现部分单链。通过某种方法，将形成杂交双链的片段
排除（消减），未形成完整杂交体的DNA或cDNA片段分离出来，即
可得到相应的片段或探针。
一个标准的克隆外源片段过程
质粒载体必须具备的基本条件
(i)具有复制起点
(ii)具有可选择的标记
(iii)具有若干限制酶单一识别位点
(iv)具有较小的分子量和较高的拷贝数
(v)作为表达载体还有启动子，转录、翻译信号，
终止子序列等片段。
lacZ
The struction of plasmid
screen
cloning
•λ噬菌体载体： Charon系列，分为取代型和插入型：
植物转基因——抗虫棉
动物转基因—生物反应器
二 分子杂交与印迹技术
Molecular hybridization
& blotting technology
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
在 DNA 复性过程中，把不同 DNA 单链分 子放在同一溶液中，或把 DNA 与 RNA 放在一 起，只要在 DNA 或 RNA 的单链分子之间有一 定的碱基配对关系，就可在不同的分子之间形 成杂化双链的这种现象。
一 基因工程与分子克隆
(genetic engineering and molecular cloning)
Research content:
genomic library, cDNA library, gene
cloning, gene expression, gene regulation,
中心法则给了我们一些启示：
①遗传信息由DNA上的基因决定。一旦基 因发生突变，将最终导致所翻译的蛋白质 发生改变，从而导致生理功能改变，甚至 出现疾病，如癌症、肥胖等。
② mRNA更能准确简便地反映DNA上基因所 携带的遗传信息。因此对基因序列的分析， 常分析mRNA的序列即可。
③基因的表达有组织特异性，且受许多因 素的影响，使mRNA的表达增强、降低甚至 关闭，从而影响机体正常生理功能，甚至 出现疾病。
①DNA(或RNA)是水溶性的。这是由于含有 磷酸基因、羟基和氨基。在核酸提取过程 中，我们保留的是水相、而不是有机相。
②核酸是两性电离，既带正电荷，又带负 电荷。它的等电点(PI)为2～2.5。在中性 溶液中带负电荷。对核酸进行电泳时，点 样时应点在负极；杂交时选择尼龙膜时， 最好选择带正电荷的尼龙膜。(核酸带负电荷，
因此常需要检测mRNA的表达的丰度(含量)， 常用方法有Northernblot、RT-PCR。定量 (Real time)PCR等。
这里需要特别强调：在检测mRNA(或蛋白) 表达时，一定要先弄清该基因在某种组织 中是否有表达。
④根据中心法则，可以RNA为模板，在逆 转录酶作用下形成cDNA，于是建立了RTPCR的方法。 ⑤根据mRNA的3’端有poly(A)的特点，在 进行反转录时，就以poly(A)为模板设计 了引物。并且纯化mRNA的方法，也是根据 poly(A)的原理设计的。
五碳糖为核糖(不是脱氧核糖)；
碱基中有尿嘧啶U(uracil)而没有胸腺嘧 啶 RNA为单链，不是双链，但RNA单链之间 相邻的碱基可由氢键作用形成局部双链。 DNA存在于细胞核的染色体、线粒体以及 染色体以外的质粒中(质粒是一些双链，闭 环的DNA分子)。
DNA(或RNA) 结构给我们的启示
（4）1910年，现代实验遗传学奠基人 TH.Morgan和他的研究生在研究果蝇的遗 传规律时发现了基因的连锁律和交换律。
（5）1944年，OT.Avery等人（3人）分离 出细菌 DNA，并发现DNA是携带生命遗传 物质的分子。 （6）1950年，Astbury在一次演讲中，首 次使用了 “分子生物学” 术语。
（10） 1961年，F.Jacob和J.Monod提出了乳糖 操纵子学说。 （11）1970年，发现了逆转录酶。
（12）自1946年起的20年当中，陆续发现了许 多质粒；1968年至1970年又发现了许多限制性 内切酶，为DNA体外重组提供了有利工具。
（13）1973年，重组DNA技术问世。 （14）1986年，K.Mullis等建立了PCR技术 （15）1990年，人类基因组计划。
gene knockout
一、用于基因克隆的工具酶 (enzymes for gene
cloning)
在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和
RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶
系统称为工具酶。
限制性内切酶及由宿主控制的限制与修饰作用
由宿主控制的限制与修饰作用使得
细菌避免噬菌体感染，如果噬菌体DNA
取代型可接受20kb左右的外源DNA， 适合于构建基因组文库。
插入型只可接受10kb以内的外源DNA， 适合于构建cDNA文库。
2、目标基因的获得
（1）人工合成（一般限于数十个核苷酸的片段）
其原理是在测定肽链或蛋白顺序的基础上， 根据遗传密码推测mRNA序列和DNA序列，经严格设计、 以化学法合成DNA。生长激素释放抑制因子、胰岛素、 干扰素表皮生长因子等基因都曾以这样的方法合成， 这种合成还可分段进行，继后再连接。但这类方法 很难考虑遗传密码简并以及内含子的存在等问题。
杂交的原理实质是核酸分子的变性与复性过程
复性
RNA
DNA
（一）印迹技术
1. 具体步骤 Southern E 1975年首次应用
容易吸附到带正电荷的膜上，牢固，不掉)
③DNA在细胞中存在部位不同(细胞核、线粒 体、质粒)，所以应注意提取方法的不同
④由于DNA空间构象不同，在电泳时迁移率 不同。 ⑤根据碱基互补配对原则，可设计引物和探 针杂交。 ⑥由于DNA的双螺旋结构和RNA易由于分子内 氢链作用形成二级结构，所以在进行杂交等 反应时，首先应加热变性，破坏二级结构。
2.一些重要理论important theory DNA的结构、复制、中心法则
基本构成单位是核苷酸
核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸构成。
碱基分别是腺嘌呤 (A)、鸟嘌呤 (G)、 胸腺嘧啶 (T)和胞嘧啶(C)。 相邻的两个核苷酸以磷酸二酯键相连
进一步盘旋、折叠，形百度文库三级或四级结构
RNA与DNA有如下不同点：
以DNA为模板，合成RNA的过程。
非模板链称为有意义链，而模板常称为反义链。 转录的过程大致是这样的： 以DNA一条链为模板，
诱导RNA聚合酶活性、RNA聚合酶识别并结合在 转录起始位点 以ATP、GTP、CTP和UTP为前体，合成(转录)RNA

当遇到转录终止信号时，转录即停止。
由RNA →蛋白质的过程，又叫翻译。只有聚合 酶II催化的反应产物是mRNA，而只有mRNA才翻译 成蛋白质。 基因(DNA)上三个相邻的碱基组成一个密码子， 一个密码子决定一种特定的氨基酸，共有43=64个 密码子。 在转录过程中，基因上的三联密码子转录成 mRNA上的三联密码子。 mRNA由核内转移至细胞浆中的核糖体上，以三 联密码子指导合成蛋白质。 翻译后的蛋白质需要加工修饰。
没有被修饰过，进入宿主就会被限制性 酶切断。如果被修饰过，其侵染细菌的
效率就提高。
二、分子克隆 (Molecular Cloning)
1. Vectors
Vectors: A DNA (a plasmid or a phage DNA) that serves as a carrier in gene cloning experiments.
中心法则
遗传信息的传递是： DNA→RNA→多肽(蛋白质) 在逆转录酶的作用下，RNA可形成cDNA， 然后再由RNA→蛋白质 以上就是完整的中心法则理论，亦可称 为基因的表达(expression)。
中 心 法 则
转录(transcription)
有意义链
反义链 反义链
转录(transcription)
⑥根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建 立不同的蛋白质提取方法，如在线粒体， 在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中。
第二节 常用分子生物学技术
本章常用技术词汇
Molecular Cloning Vectors plasmid phage cDNA genomic libraries cDNA libraries DNA ligation Recombinant DNA molecules Transformation Selection chromosome walking molecular hybridization DNA sequencing The polymerase chain reaction (PCR) inverse PCR reverse transcriptase PCR Quantitative PCR asymmetric PCR RNAi Multiplex PCR Southern Blotting DNA fingerprinting Western blotting Northern blotting Arbitrary primer PCR fluorescence in situ hybridization (FISH) Gene chip or DNA chip
第六章
常用分子生物学技术的 原理及应用
The popular technology in molecular biology: principle and application
第一节 分子生物学发展概述
概 述
分子生物学molecular biology是在分子水平上 研究生物的结构、组织和功能的科学。
DNA的复制
在解旋酶的作用下，打开DNA双链


在特定的复制起始点
以每条DNA链为模板 在DNA聚合酶的催化下
以4种脱氧核苷酸为前体物，合成 一条互补DNA链。 DNA的复制称为半保留复制。
DNA 半 不 连 续 复 制
DNA的复制给了我们一些启示
① PCR技术的原理：在体外要靠温度(90℃ 以上)打双链，而不是解旋酶，也是以DNA为 模板，需要引物，需DNA聚合酶，需要dNTP 为前体。PCR与体内(细胞内)DNA复制的最大 差异是温度。 ②检测核分裂指数：在细胞培养中，加入3H 标记的dNTP前体物，被细胞摄取后，参与 DNA复制，复制速度越快，参入的3H标记的 dNTP越多，可用液闪计数仪检测放射性强度， 据此判断。