免疫细胞实验技术

2、抗体形成细胞测定： 溶血空斑试验
溶血空斑形成试验 (hemolytic plaque assay, HPA) 即B细胞功能的一种方法，由Jerne创建，主 要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功 能的影响，评价免疫治疗或免疫重建后机体 产生抗体的能力。
1)经典溶血空斑形成试验 用于检测实验动物抗体形成细胞的功能。
五、吞噬细胞的分离和收集
1）Percoll分离法或洗淘法 此法从外周血中分离出单核-巨噬细胞， 但由于此类细胞在外周血中的含量较低， 分离时所需的血量较多。
2）斑螯敷法
此法可从人体组织液中获取较纯的吞噬细 胞。 方法是：用滤纸蘸取10%中药斑螯酒精浸 出液，贴敷在臂内侧皮肤表面，4~5小时后皮 肤局部充血，48小时后局部形成水泡，吸取 水泡中的组织液，内含大量巨噬细胞。但此 法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起局部 感染。
（3）细胞能量代谢测定（MTT比色法）：
活的增殖细胞在能量代谢过程中产生琥珀酸脱 氢酶，使黄色可溶性的MTT（四甲基偶氮唑盐）还 原为蓝黑色的不溶性结晶状甲臢，其生成量与细 胞代谢活跃程度呈正比，由此可间接定量分析细 胞增殖水平。 此法敏感性与125I-UdR掺入法大致相同，且经 济、简便、无放射性污染。
方法：将包被有关抗体的磁珠与待分离细 胞充分作用，这样借助于抗体磁珠，将与相应 的细胞结合成：细胞－抗体－磁珠复合物，该 细胞在磁场中运动与其他细胞产生明显差别。 如采用层析的方法，将层析柱放于强磁场中， 与磁珠结合的细胞运动将受限，而未与磁珠结 合的细胞将先被洗脱下出来，再将该柱移出磁 场，与结合的细胞也将被洗脱下来，达到分离 目的。
2、T细胞介导的细胞毒试验
方法学原理： ① CTL 来源：免疫动物脾脏或腹腔渗出液；或将脾 细胞与刺激细胞共同孵育，在体外诱生CTL； ②刺激细胞：预处理后失去增殖能力但仍具有免疫 原性的细胞； ③检测CTL细胞毒活性： 形态学检测法、放射性核素（ 51 Cr、125I-UdR） 释放法、乳酸脱氢酶释放法及流式细胞术等。
5）磁性激活细胞分离器（MACS）分离法 磁性微球是将磁性材料颗粒表面进行外理， 微球的核心为小金属颗粒，核心处包裹高分子 材料（聚苯乙烯），可结合不同的生物大分子 物质（抗原、抗体、核酸等），若微球表面包 被有免疫物质者称为免疫磁珠，其兼有免疫配 基的性质和磁响应性质，即在磁场中显示磁性， 移出磁场时磁性消除。目前商品出售的磁珠有 直径为1~5um等不同的规格，表面活性基团有氨 基（－NH2）、羧基（－COOH）和羟基（－OH） 等，包被的免疫物质有：一抗、二抗等。
3、去除单核细胞和粒细胞 原理：
利用单核细胞在37℃和Ca离子存在
条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙
毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此
建立许多从单个核细胞中除去单核细胞的
方法，以获得高纯度的淋巴细胞群
(1)粘附贴壁法
因B细胞也有贴壁现象，因此，本法分离
的淋巴细胞群中B细胞有所损失。 (2)吸附柱过滤法 将单核细胞吸附于玻璃柱中，有粘附能 力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层，洗 脱下来的主要是淋巴细胞
二、T细胞功能测定
1、T细胞增殖（转化）试验 T 细 胞 在体 外 受抗 原 或丝 裂原 （ PHA、 ConA）刺激后，细胞代谢和形态发生变化， 主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，发 生一系列Байду номын сангаас殖反应，并转变为淋巴母细胞。
1）形态学观察： 依据淋巴母细胞转化的形态学特征，借助光学显 微镜进行检测。 优点：方法较简单，无需特殊仪器设备。 缺点：依靠肉眼观察形态学变化，准确性较差。 2）放射性核素（3H-TdR、125I-UdR）掺入法： T细胞增殖，其胞内新合成DNA需摄取核苷酸原 料，故应用核素标记的核苷酸参与反应，通过测定 放射性强度可反映淋巴细胞增殖水平。 优点：灵敏，可自动操作。 缺点：若操作不规范，可影响实验结果重复性，另 存在放射性核素污染危险。
原理:将SRBC免疫小鼠，与一定量SRBC混合， 在补体参与下，使抗体产生细胞周围 的SRBC溶解，形成肉眼可见的圆形透 明的溶血空斑。 每一个空斑表示一个抗体形成细胞， 空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体 的多少。
2）反向空斑形成试验:体外检测人类Ig分泌细胞的方法 原理
葡萄球菌蛋白A (SPA)能与人及多种哺乳动物IgG 的Fc段呈非特异性结合。抗人Ig抗体可与待检细 胞产生的Ig结合形成复合物，复合物上的Fc段可 与连接在SRBC上的SPA结合，同时激活补体，使 SRBC溶解形成空斑。
（fluorescence activated cell sorter,FACS）
细胞经荧光染色后，通过高速流动系统， 细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。 当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡动 液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴 (4000个/s)，每小滴内最多含一个细胞，细 胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电 倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑 处理，分辨细胞的类型。
正常人PMB中T细 用mIgM、mIgD单克隆抗体检测患者外 胞占65~75% 周血B细胞表面相应的抗原已检测B细 CD4+ / CD8+约为1.5~2
胞的数量
正常人外周血中SmIg+ 细胞占8~12%
第三节 免疫细胞功能测定
吞噬细胞功能检测 T细胞功能测定 B细胞功能测定 NK细胞功能检测
一、吞噬细胞功能测定
免疫细胞的实验技术
免疫细胞的分离 免疫细胞的测定
免疫细胞功能的测定
第一节 免疫细胞的分离
用体外方法对机体各种具有免疫反应的 细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察 机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将 各种参与免疫反应的细胞分离出来。 参与免疫的细胞主要包括：淋巴细胞、 巨噬细胞、中性粒细胞等。
3、T细胞分泌功能测定 体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗
原刺激后，分泌多种CK，可借助免疫学、 细胞学及分子生物学方法分别检测CK含量、
生物学活性或基因表达水平，以反映T细
胞功能。 4、T细胞功能体内检测法 OT试验（IV型超敏反应）
三、B细胞功能测定
1、B细胞增殖试验
原理：与T细胞增殖试验相同， 刺激物： 富含SPA的金葡菌Cowan-1株（简称SAC）、 细菌脂多糖（ lipopolysaccharide，LPS，主要针对 小鼠B细胞）、 抗IgM抗体及EB病毒等。
淋 巴 细 胞
T细胞：CD2、CD3、CD4、 CD8、CD25等 B细胞：CD19、CD20、CD21、 CD22、CD29等
1)E花环沉淀法
方法：淋巴细胞+SRBC悬液→加入淋巴 细胞分层液→悬液中为B细胞 → T细胞 形成E花环而沉于管底。
2）尼龙棉柱分离法
方法： B细胞易黏附于尼龙棉纤维（聚 酰胺纤维）表面，而T细胞则不易黏附， 借此可将T细胞与B细胞分离。
3）小鼠腹腔吞噬细胞的收集：
以灭菌巯基乙醇酸盐肉汤培养基 （或无菌液体石蜡、淀粉等）注入小鼠腹 腔内，引起无菌性炎性渗出，从腹腔冲洗 液中可获得大量巨噬细胞（＞85%）
第二节
淋巴细胞测定
间接免疫荧光法：鉴定细胞的群、亚群。
用CD3、CD4、CD8单克隆抗体检测患者外周血 T细胞表面相应抗原 CD3+ ——T细胞，计算T细胞总数。 CD4+ —— CD4+T细胞，计算CD4+T细胞数。 CD8+——CD8+ T细胞，计算 CD8+亚群T细胞数 计算CD4+ / CD8+比例
溶解
激活补体
四 NK细胞活性测定
形态学检测法 放射性核素（51Cr、125I-UdR）释放法 乳酸脱氢酶释放法
及流式细胞术
中性粒细胞在吞噬、杀菌过程中，能量消耗骤增，
氧需要量增加。己糖磷酸旁路糖代谢活性增强；葡
萄糖分解的中间产物6-磷酸葡萄糖在氧化脱氢转变
为戊糖过程中，所释放的氢被摄入吞噬体的NBT染料 接受，使其被还原成蓝黑色点状或块状甲臢颗粒， 沉积于中性粒细胞胞质内。一般以阳性细胞数超过 10%判定为NBT试验阳性。
分离细胞的基本原理
1、细胞的基本特性－粗分离 如大小、沉降率、吸附性、吞噬性等 2、细胞的膜表面标志－细分离 借助于各种仪器及单克隆抗体技术的 发展
一、白细胞的分离
血液中红细胞与白细胞的比重 不同,其沉降速度也不同，通常用 两种方法加以分离。 1、自然沉降法 2、聚合物加速沉淀法
二、外周血单个核细胞的分离 人血液中各种细胞的密度如下： 红细胞：1.093 粒细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075~1.090 血小板：1.030~1.035 单个核细胞包括： 淋巴细胞和单核细胞。
(3)磁铁吸引法
利用单核细胞具有吞噬的特性，在悬液中
加入羰基铁颗粒，待单核细胞吞噬铁颗粒后，
用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋
巴细胞群。
（4）苯丙氨酸甲酯法 苯丙氨酸甲酯具有亲溶酶体性质，用该法 可溶解含溶酶体的细胞（如单核、粒细胞等）。
四、淋巴细胞亚群的分离
分 阳性选择法：纯化所需的细胞 离 方 阴性选择法：去除不要的细胞， 留下所需细胞 法
分离血细胞常用的方法为：
1、聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque， F-H）密度梯度离心法 2、Percoll密度梯度离心法
2、Percoll分层液 是一种连续密度梯度离心分离法，其主 要成分为：硅胶颗粒，其原液密度为： 1.135。
三、淋巴细胞的纯化
1、去除红细胞 无菌蒸馏水低渗裂解法 0.83%氯化铵处理法。 2、去除血小板 离心洗涤或胎牛血清（FCS）梯度离 心法
3）亲和板结合分离法 —洗淘法（panning）
• 抗体包被塑料平皿或细胞培养瓶板）+细胞，吸附表 达特定抗原的细胞：分离CD4+ 或CD8+ 细胞，则可 用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附 。 • 特异性抗原（配体）包被+表达相应受体的细胞，该 细胞被分离。如：活化的C3包被，可分离出有C3受体的细
（3）化学发光测定法
中性粒细胞在吞噬过程中出现呼吸爆 发，产生活性氧代谢产物；后者参与胞 内杀菌作用，同时能激发胞内某些物质 产生化学发光；应用鲁米诺（ luminol） 作为发光增强剂，用光度计测量发光强 度。
3、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定
巨噬细胞 + 鸡红细胞（具有清晰可 见的胞核）吞噬试验，计算吞噬率和吞 噬指数。
2、吞噬、杀菌功能测定
（1）显微镜检法 吞噬细胞与葡萄球菌或白色念珠菌 悬液混合、温育，取样制片、固定、染 色；在油镜下观察多形核白细胞对细菌 的吞噬情况，计算其吞噬率（%）和吞噬 指数（phagocytic index）及杀菌率。
2）硝基蓝四氮唑（nitrblue tetrazolium，NBT） 还原试验
1、趋化功能测定 （1）滤膜渗透法（Boyden小室法） 在上室加入待测细胞，下室加入趋化 成分，上下室间被具有一定孔径和厚度 的纤维膜隔开，反应后取纤维膜清洗后 进行固定、染色和透明化，在高倍镜下 观察细胞穿越纤维膜的移动距离，从而 判断其趋化作用。
（2）琼脂糖平板法：
在琼脂糖平板中央孔内加白细胞悬液，两侧孔 内分别加趋化因子或对照液，反应后通过固定 和染色，观察细胞定向移动能力。
直接法：将特异性抗体与磁性微粒交联，称为免疫 磁珠（IMB），其可与表达相应膜抗原的细胞结合；
应用强磁场分离IMB及其所吸附细胞，从而对特定
细胞进行阴性或阳性分选。 间接法：用抗小鼠IgG抗体（第二抗体）包被磁性微 珠，可与任何已结合鼠源性单克隆抗体（一抗） 的细胞发生反应，从而对细胞进行分离。
（6）荧光激活细胞分离仪分离法
胞。
• 优点： 可同时进行细胞的阳性分选和阴 性分选，且所获细胞量较大。 • 缺点： 免疫吸附分离法一般适合进行阴 性分选。此外，包被的抗体宜采用不含 Fc段的（Fab’）2抗体片段，以免发生非 特异性吸附。
（4）补体细胞毒分离法
抗体+细胞+补体，通过补体依赖的细
胞毒作用（CDC）而清除相应细胞，用于 细胞阴性分选。