免疫细胞实验技术

3、去除单核细胞和粒细胞 原理：
利用单核细胞在37℃和Ca离子存在
条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙
毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此
建立许多从单个核细胞中除去单核细胞的
方法，以获得高纯度的淋巴细胞群
(1)粘附贴壁法
因B细胞也有贴壁现象，因此，本法分离
的淋巴细胞群中B细胞有所损失。 (2)吸附柱过滤法 将单核细胞吸附于玻璃柱中，有粘附能 力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层，洗 脱下来的主要是淋巴细胞
胞。
• 优点： 可同时进行细胞的阳性分选和阴 性分选，且所获细胞量较大。 • 缺点： 免疫吸附分离法一般适合进行阴 性分选。此外，包被的抗体宜采用不含 Fc段的（Fab’）2抗体片段，以免发生非 特异性吸附。
（4）补体细胞毒分离法
抗体+细胞+补体，通过补体依赖的细
胞毒作用（CDC）而清除相应细胞，用于 细胞阴性分选。
溶解
激活补体
四 NK细胞活性测定
形态学检测法 放射性核素（51Cr、125I-UdR）释放法 乳酸脱氢酶释放法
及流式细胞术
中性粒细胞在吞噬、杀菌过程中，能量消耗骤增，
氧需要量增加。己糖磷酸旁路糖代谢活性增强；葡
萄糖分解的中间产物6-磷酸葡萄糖在氧化脱氢转变
为戊糖过程中，所释放的氢被摄入吞噬体的NBT染料 接受，使其被还原成蓝黑色点状或块状甲臢颗粒， 沉积于中性粒细胞胞质内。一般以阳性细胞数超过 10%判定为NBT试验阳性。
2、吞噬、杀菌功能测定
（1）显微镜检法 吞噬细胞与葡萄球菌或白色念珠菌 悬液混合、温育，取样制片、固定、染 色；在油镜下观察多形核白细胞对细菌 的吞噬情况，计算其吞噬率（%）和吞噬 指数（phagocytic index）及杀菌率。
2）硝基蓝四氮唑（nitrblue tetrazolium，NBT） 还原试验
1、趋化功能测定 （1）滤膜渗透法（Boyden小室法） 在上室加入待测细胞，下室加入趋化 成分，上下室间被具有一定孔径和厚度 的纤维膜隔开，反应后取纤维膜清洗后 进行固定、染色和透明化，在高倍镜下 观察细胞穿越纤维膜的移动距离，从而 判断其趋化作用。
（2）琼脂糖平板法：
在琼脂糖平板中央孔内加白细胞悬液，两侧孔 内分别加趋化因子或对照液，反应后通过固定 和染色，观察细胞定向移动能力。
淋 巴 细 胞
T细胞：CD2、CD3、CD4、 CD8、CD25等 B细胞：CD19、CD20、CD21、 CD22、CD29等
1)E花环沉淀法
方法：淋巴细胞+SRBC悬液→加入淋巴 细胞分层液→悬液中为B细胞 → T细胞 形成E花环而沉于管底。
2）尼龙棉柱分离法
方法： B细胞易黏附于尼龙棉纤维（聚 酰胺纤维）表面，而T细胞则不易黏附， 借此可将T细胞与B细胞分离。
方法：将包被有关抗体的磁珠与待分离细 胞充分作用，这样借助于抗体磁珠，将与相应 的细胞结合成：细胞－抗体－磁珠复合物，该 细胞在磁场中运动与其他细胞产生明显差别。 如采用层析的方法，将层析柱放于强磁场中， 与磁珠结合的细胞运动将受限，而未与磁珠结 合的细胞将先被洗脱下出来，再将该柱移出磁 场，与结合的细胞也将被洗脱下来，达到分离 目的。
3）小鼠腹腔吞噬细胞的收集：
以灭菌巯基乙醇酸盐肉汤培养基 （或无菌液体石蜡、淀粉等）注入小鼠腹 腔内，引起无菌性炎性渗出，从腹腔冲洗 液中可获得大量巨噬细胞（＞85%）
第二节
淋巴细胞测定
间接免疫荧光法：鉴定细胞的群、亚群。
用CD3、CD4、CD8单克隆抗体检测患者外周血 T细胞表面相应抗原 CD3+ ——T细胞，计算T细胞总数。 CD4+ —— CD4+T细胞，计算CD4+T细胞数。 CD8+——CD8+ T细胞，计算 CD8+亚群T细胞数 计算CD4+ / CD8+比例
原理:将SRBC免疫小鼠，与一定量SRBC混合， 在补体参与下，使抗体产生细胞周围 的SRBC溶解，形成肉眼可见的圆形透 明的溶血空斑。 每一个空斑表示一个抗体形成细胞， 空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体 的多少。
2）反向空斑形成试验:体外检测人类Ig分泌细胞的方法 原理
葡萄球菌蛋白A (SPA)能与人及多种哺乳动物IgG 的Fc段呈非特异性结合。抗人Ig抗体可与待检细 胞产生的Ig结合形成复合物，复合物上的Fc段可 与连接在SRBC上的SPA结合，同时激活补体，使 SRBC溶解形成空斑。
2、T细胞介导的细胞毒试验
方法学原理： ① CTL 来源：免疫动物脾脏或腹腔渗出液；或将脾 细胞与刺激细胞共同孵育，在体外诱生CTL； ②刺激细胞：预处理后失去增殖能力但仍具有免疫 原性的细胞； ③检测CTL细胞毒活性： 形态学检测法、放射性核素（ 51 Cr、125I-UdR） 释放法、乳酸脱氢酶释放法及流式细胞术等。
（fluorescence activated cell sorter,FACS）
细胞经荧光染色后，通过高速流动系统， 细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。 当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡动 液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴 (4000个/s)，每小滴内最多含一个细胞，细 胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电 倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑 处理，分辨细胞的类型。
直接法：将特异性抗体与磁性微粒交联，称为免疫 磁珠（IMB），其可与表达相应膜抗原的细胞结合；
应用强磁场分离IMB及其所吸附细胞，从而对特定
细胞进行阴性或阳性分选。 间接法：用抗小鼠IgG抗体（第二抗体）包被磁性微 珠，可与任何已结合鼠源性单克隆抗体（一抗） 的细胞发生反应，从而对细胞进行分离。
（6）荧光激活细胞分离仪分离法
二、T细胞功能测定
1、T细胞增殖（转化）试验 T 细 胞 在体 外 受抗 原 或丝 裂原 （ PHA、 ConA）刺激后，细胞代谢和形态发生变化， 主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，发 生一系列增殖反应，并转变为淋巴母细胞。
1）形态学观察： 依据淋巴母细胞转化的形态学特征，借助光学显 微镜进行检测。 优点：方法较简单，无需特殊仪器设备。 缺点：依靠肉眼观察形态学变化，准确性较差。 2）放射性核素（3H-TdR、125I-UdR）掺入法： T细胞增殖，其胞内新合成DNA需摄取核苷酸原 料，故应用核素标记的核苷酸参与反应，通过测定 放射性强度可反映淋巴细胞增殖水平。 优点：灵敏，可自动操作。 缺点：若操作不规范，可影响实验结果重复性，另 存在放射性核素污染危险。
（3）细胞能量代谢测定（MTT比色法）：
活的增殖细胞在能量代谢过程中产生琥珀酸脱 氢酶，使黄色可溶性的MTT（四甲基偶氮唑盐）还 原为蓝黑色的不溶性结晶状甲臢，其生成量与细 胞代谢活跃程度呈正比，由此可间接定量分析细 胞增殖水平。 此法敏感性与125I-UdR掺入法大致相同，且经 济、简便、无放射性污染。
3、T细胞分泌功能测定 体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗
原刺激后，分泌多种CK，可借助免疫学、 细胞学及分子生物学方法分别检测CK含量、
生物学活性或基因表达水平，以反映T细
胞功能。 4、T细胞功能体内检测法 OT试验（IV型超敏反应）
三、B细胞功能测定
1、B细胞增殖试验
原理：与T细胞增殖试验相同， 刺激物： 富含SPA的金葡菌Cowan-1株（简称SAC）、 细菌脂多糖（ lipopolysaccharide，LPS，主要针对 小鼠B细胞）、 抗IgM抗体及EB病毒等。
五、吞噬细胞的分离和收集
1）Percoll分离法或洗淘法 此法从外周血中分离出单核-巨噬细胞， 但由于此类细胞在外周血中的含量较低， 分离时所需的血量较多。
2）斑螯敷法
此法可从人体组织液中获取较纯的吞噬细 胞。 方法是：用滤纸蘸取10%中药斑螯酒精浸 出液，贴敷在臂内侧皮肤表面，4~5小时后皮 肤局部充血，48小时后局部形成水泡，吸取 水泡中的组织液，内含大量巨噬细胞。但此 法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起局部 感染。
5）磁性激活细胞分离器（MACS）分离法 磁性微球是将磁性材料颗粒表面进行外理， 微球的核心为小金属颗粒，核心处包裹高分子 材料（聚苯乙烯），可结合不同的生物大分子 物质（抗原、抗体、核酸等），若微球表面包 被有免疫物质者称为免疫磁珠，其兼有免疫配 基的性质和磁响应性质，即在磁场中显示磁性， 移出磁场时磁性消除。目前商品出售的磁珠有 直径为1~5um等不同的规格，表面活性基团有氨 基（－NH2）、羧基（－COOH）和羟基（－OH） 等，包被的免疫物质有：一抗、二抗等。
正常人PMB中T细 用mIgM、mIgD单克隆抗体检测患者外 胞占65~75% 周血B细胞表面相应的抗原已检测B细 CD4+ / CD8+约为1.5~2
胞的数量
正常人外周血中SmIg+ 细胞占8~12%
第三节 免疫细胞功能测定
吞噬细胞功能检测 T细胞功能测定 B细胞功能测定 NK细胞功能检测
一、吞源自文库细胞功能测定
(3)磁铁吸引法
利用单核细胞具有吞噬的特性，在悬液中
加入羰基铁颗粒，待单核细胞吞噬铁颗粒后，
用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋
巴细胞群。
（4）苯丙氨酸甲酯法 苯丙氨酸甲酯具有亲溶酶体性质，用该法 可溶解含溶酶体的细胞（如单核、粒细胞等）。
四、淋巴细胞亚群的分离
分 阳性选择法：纯化所需的细胞 离 方 阴性选择法：去除不要的细胞， 留下所需细胞 法
免疫细胞的实验技术
免疫细胞的分离 免疫细胞的测定
免疫细胞功能的测定
第一节 免疫细胞的分离
用体外方法对机体各种具有免疫反应的 细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察 机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将 各种参与免疫反应的细胞分离出来。 参与免疫的细胞主要包括：淋巴细胞、 巨噬细胞、中性粒细胞等。
（3）化学发光测定法
中性粒细胞在吞噬过程中出现呼吸爆 发，产生活性氧代谢产物；后者参与胞 内杀菌作用，同时能激发胞内某些物质 产生化学发光；应用鲁米诺（ luminol） 作为发光增强剂，用光度计测量发光强 度。
3、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能测定
巨噬细胞 + 鸡红细胞（具有清晰可 见的胞核）吞噬试验，计算吞噬率和吞 噬指数。
分离细胞的基本原理
1、细胞的基本特性－粗分离 如大小、沉降率、吸附性、吞噬性等 2、细胞的膜表面标志－细分离 借助于各种仪器及单克隆抗体技术的 发展
一、白细胞的分离
血液中红细胞与白细胞的比重 不同,其沉降速度也不同，通常用 两种方法加以分离。 1、自然沉降法 2、聚合物加速沉淀法
二、外周血单个核细胞的分离 人血液中各种细胞的密度如下： 红细胞：1.093 粒细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075~1.090 血小板：1.030~1.035 单个核细胞包括： 淋巴细胞和单核细胞。
2、抗体形成细胞测定： 溶血空斑试验
溶血空斑形成试验 (hemolytic plaque assay, HPA) 即B细胞功能的一种方法，由Jerne创建，主 要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功 能的影响，评价免疫治疗或免疫重建后机体 产生抗体的能力。
1)经典溶血空斑形成试验 用于检测实验动物抗体形成细胞的功能。
3）亲和板结合分离法 —洗淘法（panning）
• 抗体包被塑料平皿或细胞培养瓶板）+细胞，吸附表 达特定抗原的细胞：分离CD4+ 或CD8+ 细胞，则可 用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附 。 • 特异性抗原（配体）包被+表达相应受体的细胞，该 细胞被分离。如：活化的C3包被，可分离出有C3受体的细
分离血细胞常用的方法为：
1、聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque， F-H）密度梯度离心法 2、Percoll密度梯度离心法
2、Percoll分层液 是一种连续密度梯度离心分离法，其主 要成分为：硅胶颗粒，其原液密度为： 1.135。
三、淋巴细胞的纯化
1、去除红细胞 无菌蒸馏水低渗裂解法 0.83%氯化铵处理法。 2、去除血小板 离心洗涤或胎牛血清（FCS）梯度离 心法