坂崎肠杆菌检验文稿演示
食品微生物之检验方法-阪崎肠杆菌之检验
附件食品微生物之檢驗方法－阪崎腸桿菌之檢驗1 適用範圍〆本方法適用於一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。
2 檢驗方法〆2.1 工作環境〆工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。
每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。
2.2 器具及材料〆2.2.1 乾熱滅菌器。
2.2.2 高壓滅菌釜。
2.2.3 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）〆適用於無菌操作者。
2.2.4 天平〆可稱量到2000 g者，靈敏度為0.1 g々可稱量到120 g者，靈敏度為1 mg。
2.2.5 冰箱〆能維持5 ±3℃者。
2.2.6 吸管或吸管尖〆已滅菌，1 mL吸管應有0.01 mL之刻度々5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL之刻度。
2.2.7 吸管輔助器（Pipette aid）或微量分注器。
2.2.8 稀釋瓶〆160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、鐵弗龍（Teflon）或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質，附螺旋蓋。
2.2.9 培養皿〆已滅菌，內徑約9 cm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮傷或其他缺點。
2.2.10 增菌用容器〆附螺旋蓋之125 mL、250 mL、2 L三角錐瓶或廣口瓶々玻璃、聚乙烯、鐵弗龍或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質。
2.2.11 pH測定儀。
2.2.12 培養箱〆能維持內部溫度在±1℃以內者。
2.2.13 溫度計〆量測溫度範圍1～55℃，最小刻度0.1℃。
2.2.14 水浴〆加蓋，具水流循環系統，能維持水溫溫差在±0.2℃以內者。
2.2.15 接種針及接種環（直徑約3 mm）〆鎳鉻合金、鉑銥或鉻線材質，或可拋棄式者。
2.2.16 曲玻棒〆可滅菌者，直徑3～4 mm，塗抹區域45～55 mm。
2.2.17 試管〆10 ×100 mm，13 ×100 mm，13 ×120 mm，15 ×150 mm，16 ×150 mm試管，或其他適用者。
阪崎肠杆菌_ppt课件
※氧化酶阴性
※过氧化氢酶阳性，并生成黄色菌落
营养成分表
样品
美赞臣 安婴儿婴儿配方奶粉
罐装
配料表： 100%进口奶源配料：乳糖、精炼植物油、浓缩 乳清蛋白、脱脂奶粉、低聚半乳糖（GOS）、 花生四烯酸（ARA）和二十二碳六烯酸（DHA） （来源于单细胞油）、矿物质（碳酸钙、氯化钙、 柠檬酸钾、氯化钾、氯化镁、硫酸亚铁、硫酸锌、 硫酸铜、硫酸锰、亚硒酸钠、碘化钾）、玉米糖 浆固体、维生素（维生素A、维生素D3、维生素 E、维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、 维生素B12、维生素K1、胆碱、肌醇、烟酰胺、 叶酸、泛酸、生物素）、牛磺酸、核苷酸、食品 添加剂：磷脂、抗坏血酸棕榈酸酯、氢氧化钙、 碳酸氢钾。
44 ℃±0.5 ℃ 培养24h±2h 。
10 mL mLST-Vm 肉汤
36 ℃±1 ℃培 养24 h±2 h。
各取增菌培养物1 环，分 别划线接种于两个阪崎肠 杆菌显色培养基平板
①前增菌和 增菌
②分离
挑取1 个～5 个可疑菌落，划 线接种于TSA 平板。 25 ℃±1 ℃培养48 h±4 h。
③鉴定
阪崎肠杆菌显色培养基DFI
微生物
菌落颜色
• 阪崎肠杆菌 • 大肠杆菌 • 金黄色葡萄球菌
蓝绿色 无色菌落 被抑制不生长
培养基和试剂
• 4 、胰蛋白胨大豆琼脂（trypticase soy agar， TSA）：见附录A 中A.3。
• 5 、生化鉴定试剂盒。 • 6、 氧化酶试剂：见附录A 中A.4。 • 7、 L-赖氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.5。 • 8 、L-鸟氨酸脱羧酶培养基：见附录A 中A.6。 • 9 、L-精氨酸双水解酶培养基：见附录A 中A.7
KJ06 阪崎肠杆菌普通PCR法.
阳性结果：282bp PCR扩增产物
4.结果分析
阳性：阴性和空白对照均未出现预期大小的扩增条 带；阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条 带，怀疑存在阪崎肠杆菌。 阴性：阴性、空白对照及待测样品均未出现预期大 小的扩增条带；阳性对照出现预期大小的扩增条带。 无效试验：阳性对照未出现预期大小的扩增条带。 污染可能：阴性对照和空白对照出现预期大小的扩 增条带。
试剂 仪器设备 方法步骤及注意事项 结果分析 确认试验
1.试剂
增菌： • 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（MLST） 即：在一升LST中增加氯化钠29.22克；高 压后添加万古霉素10mg/L。 • 脑心浸液（BHI） DNA提取：试剂盒
PCR试剂： 10×PCR buffer、Taq酶、dNTP、ddH2O、 引物、阳性、阴性对照DNA。 电泳： 琼脂糖（分析纯）、溴化乙锭、电泳缓冲 液、加样缓冲液、分子量标记：100 bp DNA ladder。
5.确认试验
PCR阳性结果需做确认试验。 取留存的BHI增菌液接种于VRBGA及显色培 养基，参照标准第一部分挑取可疑菌落进行 鉴定。
6.检验程序
样品100 g加入900 mL MLST中 44°Байду номын сангаас 22 h～24 h
0.2mL MLST增菌液加到5 mL BHI中 36℃1℃ 水浴4h PCR 检测 阴性 阳性
SN/T 1632.1-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检测方法
第2部分
奶粉中阪崎肠杆菌的PCR检测方法
增菌液的选择
采用经试验评估的美国杜邦公司BAX系 统相关增菌方法：用改良月桂基硫酸盐 胰蛋白胨肉汤（MLST）对奶粉中阪崎肠 杆菌进行选择性增菌，再用脑心浸液 （BHI）对阪崎肠杆菌在短时间内进行快 速增殖，以供PCR检测。
阪崎肠杆菌的测定.pptx
阪崎肠杆菌的分布
1.环境 原油、切削液、苍蝇、食品加工厂（奶制品、谷类、
巧克力、马铃薯粉），医院（空气、听诊器、临床 食品）、家庭、温泉、鼠、沉积物、沼泽地、土壤 2.食品及相关用品 啤酒杯、干酪、婴儿配方奶粉和豆粉、婴儿配方粉 冲调用品（搅拌器、勺子、甁刷），普通奶粉、碎 牛肉、肉类、香肠、发酵面包、豆腐、蔬菜、水 （管道、生物膜）、调味品
冷藏条件下可以生长 5、在TSA培养基上产生黄色色素 6、产生α-葡萄糖苷酶，其它肠杆菌均不产生； 7、较强的耐干燥性，耐高渗透压， “干燥逆境抗
性”比其他，大多数乳品中分离得到的肠杆菌更 加耐热，但标准的高温短时巴氏杀菌可消灭
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易感人群
• 阪崎肠杆菌可引起各年龄段的感染，但从 报道病例的年龄分布来看，高危人群主要是 婴儿（即＜1岁的儿童），新生儿（≤28天）、 尤其是早产儿、低出生体重或免疫力下的婴 儿，发生严重感染的危险性最高。
• 母亲HIV阳性的婴儿
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主要感染渠道
虽然现在还不能确定阪 崎肠杆菌的宿主和传播 模型，但在多起新生儿 阪崎肠杆菌感染事件的 调查中发现婴幼儿配方 粉是主要的感染渠道
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阪
崎
检
1前增菌 2选择性增菌
测 3平板分离
பைடு நூலகம்
步
4平板确认 5 生化鉴定
骤
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阪崎肠杆菌检验——前增菌
操作：100g样品+900mL增菌液，培养18h±2h GB使用的增菌液为BPW 主要作用：营养丰富，更利于食品检验具有缓冲体系
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阪崎肠杆菌检验——平板分离
操作：各取培养物一环，接种显色平板，培养24h±2h 培养基作用 显色培养基 •显色培养基利用阪崎特异性α-葡萄糖苷酶原理，分解底物
食品微生物之检验方法-阪崎肠杆菌之检验
食品微生物之检验方法－阪崎肠杆菌之检验1 适用范围：本方法适用于一般食品及奶粉中阪崎肠杆菌之检验。
2 检验方法：2.1 工作环境：工作平台须宽敞、洁净、光线良好，操作平台光度为100呎烛光以上，密闭室内换气良好，尽可能没有灰尘及流动空气。
每15分钟落菌数不得超过15 CFU／培养皿。
2.2 器具及材料：2.2.1 干热灭菌器。
2.2.2 高压灭菌釜。
2.2.3 搅拌均质器（Blender）或铁胃（Stomacher）：适用于无菌操作者。
2.2.4 天平：可称量到2000 g者，灵敏度为0.1 g；可称量到120 g者，灵敏度为1 mg。
2.2.5 冰箱：能维持5 ± 3℃者。
2.2.6 吸管或吸管尖：已灭菌，1 mL吸管应有0.01 mL之刻度；5 mL及10 mL吸管应有0.1 mL 之刻度。
2.2.7 吸管辅助器（Pipette aid）或微量分注器。
2.2.8 稀释瓶：160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、铁弗龙（Teflon）或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质，附螺旋盖。
2.2.9 培养皿：已灭菌，内径约9 cm，深度约15 mm，底皿之内外面应平坦，无气泡、刮伤或其它缺点。
2.2.10 增菌用容器：附螺旋盖之125 mL、250 mL、2 L三角锥瓶或广口瓶；玻璃、聚乙烯、铁弗龙或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质。
2.2.11 pH测定仪。
2.2.12 培养箱：能维持内部温度在± 1℃以内者。
2.2.13 温度计：量测温度范围1～55℃，最小刻度0.1℃。
2.2.14 水浴：加盖，具水流循环系统，能维持水温温差在± 0.2℃以内者。
2.2.15 接种针及接种环（直径约3 mm）：镍铬合金、铂铱或铬线材质，或可抛弃式者。
2.2.16 曲玻棒：可灭菌者，直径3～4 mm，涂抹区域45～55 mm。
2.2.17 试管：10 × 100 mm，13 × 100 mm，13 × 120 mm，15 × 150 mm，16 × 150 mm试管，或其它适用者。
食品卫生微生物学检验-阪崎肠杆菌 ppt课件
阪崎肠杆菌介绍
易感人群:
免疫力低下者和婴幼儿、新生儿， 尤其是早产儿、低体重儿可以致病。感 染来源主要是受阪崎肠杆菌污染的奶粉， 人与人之间无传染性。
阪崎肠杆菌介绍
1、阪崎肠杆菌在自然界分布广泛，在水、土壤、食 物、排泄物等中都能够检出。细菌不耐热，加热到 72℃持续15秒就可以杀灭。细菌不在人与人之间传播。 2、阪崎肠杆菌在一般情况下不对人体健康产生危害， 但对于新生儿，尤其是早产儿、低体重儿可以致病。 3、绝大多数患者为轻症病例，表现为轻微的消化道 症状，恢复良好；重症病例罕见但病死率高。对于发 现的病例应及时报告。
阪崎肠杆菌介绍
阪崎肠杆菌（Enterobater sakazakii）属肠杆菌科肠杆 菌属，革兰染色阴性杆菌。阪崎肠杆菌在自然界分布 广泛，繁殖迅速，但不耐热，可通过巴斯德消毒法杀 灭。阪崎肠杆菌属条件致病菌，在一般情况下，不对 人体健康产生危害，但对于免疫力低下者和婴幼儿、 新生儿，尤其是早产儿、低体重儿可以致病。感染来 源主要是受阪崎肠杆菌污染的奶粉，人与人之间无传
食品卫生微生物学检验-阪崎肠杆菌 ppt课件
阪崎肠杆菌检验 GB/T 4789.40-2008
一、采标情况
二、适用范围 三、操作过程 1 第一法 阪崎肠杆菌的检验 2 第二法 阪崎肠杆菌的计数
阪崎肠杆菌检验 GB/T 4789.40-2008
二、适用范围
适用于婴幼儿配方奶粉、乳和乳制品及 其原料中阪崎肠杆菌的检验
挑取绿色菌落
接种TSA平板
25℃±1 ℃ 48 h ± 4 h 挑取黄色菌落
生化鉴定
阪崎肠杆菌检验
第一部分：一般特征
一．培养特征 二．生化反应 三．抵抗力 四．增殖能力
与其他常见肠杆菌相似
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一、培养特征
阪崎肠杆菌兼性厌氧，营养要求不高，能在营养琼脂、 血平板、麦康凯(MacConkey，MAC)琼脂、伊红美蓝 琼脂、脱氧胆酸琼脂等多种培养基上生长繁殖。
ES在VRBGA平板上首次划线分离时，37℃培养24h可生成2种不同 的形态学特征： 1. 干燥或粘液状、圆锯齿状（凹口或锯齿），用金属环接触时 可发现坚韧或有弹力，即粘贴金属环的菌量很少，并且菌落 可很快恢复。传代培养后可能会转变为典型的光滑菌落。 2. 光滑、易于用金属环从菌落移取细胞。
阪崎肠杆菌检验
GB 4789.40--2010
Enterobacter sakazakii(ES)
2
内
容
第一部分：一般特征 第二部分：致病性 第三部分E．sakazakii)是人和动物肠道内 寄生的一种革兰阴性无芽孢杆菌，属肠杆 菌科肠杆菌属，是肠道正常菌丛中的一种 ，在一定条件下可引起人和动物致病。 阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小 肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50% 以上 。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌 的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配 方粉是目前发现的主要感染渠道。
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二、生化反应
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• DNASE-脱氧核糖核酸酶
注：＋ ：90-100％；(＋) ：75-89%； V ：25-74％；(－)：10 -24％；－ ：0-9％
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三、抵抗力
• 耐热性 • 渗透压 • 干燥
不同菌株的耐热性存在明显的差别，但标准的巴氏消 毒过程能有效的灭活ES。 ES对渗透压的耐受性使该菌能够成为环境中的优势株， 增加PIF（婴儿配方奶）加工后污染的危险性，使其在PIF （婴儿配方奶） 中长期存活。
食品克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验原始记录
食品克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验原始记录样品编号：检验开始时间：年月日样品名称：检验完成时间：年月日检测项目：克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检测依据：GB 4789.40-2016 第一法 第二法一、克罗诺杆菌属定性检验无菌操作称（量）取样品100g或ml置于灭菌锥形中，加入900mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水，摇动充分溶解，36±1℃培养18±2h，移取1mL转种于10mLST-Vm肉汤，44±0.5℃培养24±2h。
轻轻混匀培养物，各取1环，分别划线于两个阪崎杆菌显色培养基平板，36±1℃培养24±2h。
挑取可疑菌落，划线于TSA平板，25±1℃培养48±4h。
观察，挑取可疑菌落进行生化鉴定。
二、克罗诺杆菌属平板计数法无菌操作称（量）取样品100g（ml）、10g（ml）、1g（ml）置于灭菌锥形中，加入900mL、90mL、9mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水，摇动充分溶解，36±1℃培养18±2h，移取1mL转种于10mLST-Vm肉汤，44±0.5℃培养24±2h。
轻轻混匀培养物，各取1环，分别划线于两个阪崎杆菌显色培养基平板，36±1℃培养24±2h。
挑取可疑菌落，划线于TSA平板，25±1℃培养48±4h。
挑取可疑菌落进行生化鉴定。
注：+生长或有可疑菌落；-未生长或无可疑菌落。
计算及结果：定性检验：得100g(mL) 计数法，查MPN检索表，得MPN/g,mL电子天平编号：使用状况试验前：试验后：培养箱编号：使用状况试验前：试验后：检测人：校核人：审核人：。
66食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验
A.1 缓冲蛋白胨水（BPW）
A.1.1.1 成分 蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 磷酸二氢钾 蒸馏水
pH 7.2 A.1.1.2 制法
加热搅拌至溶解,调节 pH，121 ℃高压灭菌 15 min。
10.0g 5.0 g 9.0 g 1.5 g 1 000 mL
A.7 L-精氨酸双水解酶培养基
A.7.1 成分
L-精氨酸盐酸盐（L-arginine monohydrochloride）
5.0 g
酵母浸膏 葡萄糖 溴甲酚紫
3.0 g 1.0 g 0.015 g
蒸馏水
1 000 mL
pH 6.8±0.2 A.7.2 制法
将各成分加热溶解，必要时调节 pH。每管分装 5 mL。121 ℃高压 15 min。
A.8.4 实验方法
挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基，刚好在液体培养基的液面下。30 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h， 观察结果。糖类发酵试验阳性者，培养基呈黄色，阴性者为红色。
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A.9 西蒙氏柠檬酸盐培养基
GB 4789.40—2010
A.9.1 成分
柠檬酸钠
2.0 g
氯化钠 磷酸氢二钾 磷酸二氢铵
I
GB 4789.40—2010
食品安全国家标准 食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验
1 范围
本标准规定了食品中阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）的检验方法。 本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中阪崎肠杆菌的检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 恒温培养箱：25 ℃±1 ℃，36 ℃±1 ℃，44 ℃±0.5 ℃。 2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 2.3 恒温水浴箱：44 ℃±0.5 ℃。 2.4 天平：感量 0.1 g。 2.5 均质器。 2.6 振荡器。 2.7 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 2.8 无菌锥形瓶：容量 100 mL、200 mL、2000 mL。 2.9 无菌培养皿：直径 90 mm。 2.10 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 2.11 全自动微生物生化鉴定系统。 3 培养基和试剂 3.1 缓冲蛋白胨水（buffer peptone water，BPW）：见附录 A 中 A.1。 3.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin
阪崎肠杆菌科菌种鉴定细菌成分
阪崎肠杆菌科菌种鉴定细菌成分一、引言阪崎肠杆菌科（Sakazakii Enterobacteriaceae）是一种常见的细菌科，包含多种致病性菌种。
其中的阪崎肠杆菌（Cronobacter sakazakii）是一种已知的人类致病菌，能引起新生儿脑膜炎、败血症、肺炎等严重感染。
因此，对于阪崎肠杆菌科菌种鉴定的准确性和全面性要求极高。
二、样品采集与处理1. 采集样品：从食品、环境等来源中采集样品，如奶粉、水源等。
2. 处理样品：将样品进行预处理，如加入缓冲液等，以保证后续操作的可靠性和准确性。
三、培养基选择与制备1. 培养基选择：常用的培养基有Luria-Bertani（LB）、营养琼脂（NA）、大肠杆菌选择性培养基MacConkey（MAC）等。
2. 培养基制备：按照标准配方制备培养基，并进行灭菌处理。
四、细胞分离与纯化1. 细胞分离：将样品接种到培养基中，进行静置或摇床培养，使菌落生长。
2. 细胞纯化：通过不同的方法，如差速离心、磁珠分离等，将目标细菌分离纯化。
五、生化鉴定1. 氧化酶试验：检测细菌是否具有氧化酶活性。
2. 婴儿食品模拟液培养：将细菌接种到婴儿食品模拟液中进行培养，观察是否能够生长。
3. 阳性和阴性反应检测：通过添加不同的试剂观察细菌是否产生阳性或阴性反应。
六、分子生物学鉴定1. PCR扩增：使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增。
2. 16S rRNA序列分析：对PCR扩增得到的16S rRNA序列进行测序和比对，并与数据库中的已知序列进行比较。
七、质谱鉴定1. MALDI-TOF MS技术：利用MALDI-TOF MS技术对目标菌株进行质谱分析，并与数据库中的已知质谱图谱进行比对。
八、总结阪崎肠杆菌科菌种鉴定需要综合应用多种方法，包括样品采集与处理、培养基选择与制备、细胞分离与纯化、生化鉴定、分子生物学鉴定和质谱鉴定等。
在实际操作中，需要根据具体情况选择合适的方法，并注意操作规范和安全性。
食品中阪崎肠杆菌原始记录
PITC/JJ01-WJ-0005/1-1食品中阪崎肠杆菌原始记录样品编号：样品名称：样品状态：□定型包装□散装□液态□固态收样日期：检验日期：检验项目/方法：阪崎杆菌GB 4789.40-2010仪器设备：恒温箱（36℃）PITC-411WJ-148 恒温箱（44.5℃）PITC-403WJ-140恒温箱（30℃）PITC-221WJ-104 恒温箱（26℃）PITC-221WJ-104 ATB微生物鉴定仪PITC-171步骤过程结果前增菌阳对：□NG □G 取检g/mL加入900mL以预热44℃的缓冲蛋白胨水增菌液中混匀℃培养h空白：□NG □G样品-1：□NG □G样品-2：□NG □G样品-3：□NG □G样品-4：□NG □G样品-5：□NG □G增菌阳对：□NG □G 移取1mL处理液转种于10mL mLST-Vm肉汤℃培养h空白：□NG □G样品-1：□NG □G样品-2：□NG □G样品-3：□NG □G样品-4：□NG □G样品-5：□NG □G分离分别划线接种2个阪崎显色平板℃培养h阳对：□NG □G空白：□NG □G 样品-1：□NG □G典型菌落特征按照产品说明进行判定。
样品-2：□NG □G样品-3：□NG □G样品-4：□NG □G样品-5：□NG □G挑取1~5个可疑菌落划线接种于TSA平板℃培养h阳对：□NG □G空白：□NG □G 样品-1：□NG □G典型菌落为黄色菌落。
样品-2：□NG □G样品-3：□NG □G样品-4：□NG □G样品-5：□NG □G生化鉴定结果报告（每100g或每100 mL）样品-1样品-2样品-3样品-4样品-5□ND □D□ND □D□ND □D□ND □D□ND □D注：G生长 NG不生长 D检出 ND 未检出检验者：校核者：完成日期：。
阪崎肠杆菌的测定PPT
03
样品处理与准备
样品采集与保存
采样工具
使用无菌采样工具，避免交叉污染。
采样部位
保存条件
将采集的样品立即放入无菌容器中，密 封并标识清楚，置于低温条件下保存， 以确保样品的新鲜度和避免细菌增殖。
根据检测需求，选择合适的采样部位， 如食品表面、内部或液体样品等。
样品前处理
样品均质化
对于固体或半固体样品， 需进行均质化处理，以便 后续检测。
公共卫生监测
建立阪崎肠杆菌的监测网络，及时发现和控 制食品、水源等环境中的污染问题，保障公 众健康。
08
总结与展望
研究成果总结
检测方法优化
通过改进培养基配方、提高检测灵敏度等方式，成功 建立了高效、准确的阪崎肠杆菌检测方法。
污染源追溯
利用分子生物学技术，对阪崎肠杆菌进行基因分型， 实现了对污染源头的快速识别和追溯。
保存期限
注意样品的保存期限，过期样品可 能会影响检测结果的准确性。
04
实验步骤与操作
培养基配制与灭菌
培养基选择
针对阪崎肠杆菌的生长特性，选择适当的培养基， 如阪崎肠杆菌选择性培养基。
培养基配制
按照培养基说明书或实验室标准操作程序（SOP） 进行配制，确保各成分比例准确。
灭菌处理
将配制好的培养基进行高压蒸汽灭菌，确保无菌 状态，避免实验过程中的污染。
考核与评估
定期对实验人员进行考核和评估，包括实验操作技能考核、理论知识测试等，确保实验人员能够熟练掌 握实验技能和知识。同时，对考核结果进行分析和总结，针对存在的问题进行改进和完善。
07
应用实例与案例分析
食品中阪崎肠杆菌的测定
食品样品采集与处理
从食品生产、加工、运输和储存等各环节采集样品，进行适当处 理以消除干扰因素。
阪崎肠杆菌检验方法
食品中阪崎肠杆菌检验方法1 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下：1.1 恒温培养箱：25℃±1℃，36℃±1℃，44℃±0.5℃1.2 冰箱：2℃-5℃。
1.3恒温水浴箱：44℃±0.5℃1.4天平：感量0.1g1.5 均质器1.6 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。
1.7 无菌锥形瓶：容量100mL、250mL、2 000mL。
1.8 无菌培养皿：直径90mm。
1.9 pH计或精密pH试纸。
2 培养基和试剂2.1 缓冲蛋白胨水。
2.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(mLST-Vm)2.3 阪崎肠杆菌显色培养基2.4 胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）2.5 API 20E生化鉴定试剂盒2.6 氧化酶试剂3 操作步骤3.1 前增菌和增菌取样前，应消毒检样包装的开启处。
以无菌操作，称取检样100g（mL）加至预热到44℃装有900mL灭菌缓冲蛋白胨水的2 000mL锥形瓶中，缓缓振摇使样品充分溶解，36℃±1℃培养18h±2h。
移取增菌液1mL转种于10mL mLST-Vm肉汤，44℃±0.5℃培养24h±2h。
3.2 分离3.2.1 轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌培养物1环，分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板，36℃±1℃培养24h±2h。
阪崎肠杆菌为圆形、直径1mm-2mm的蓝绿色菌落。
3.2.2 挑取1~5个可疑菌落，划线接种于TSA平板。
25℃±1℃培养48h±4h。
3.3 鉴定自TSA平板上挑取黄色菌落，采用API 20E生化鉴定试剂盒进行生化鉴定。
4 结果与报告综合菌落形态和生化特性，报告每100g（mL）样品中检出或未检出阪崎肠杆菌。
阪崎肠杆菌
阪崎肠杆菌检验 GB 4789.40—2010
Donna吴
阪崎肠杆菌 样品介绍 操作流程第一法
操作流程第二法
阪 崎 肠 杆 菌
阪崎肠杆菌
阪崎肠杆 菌能引起 （又称阪崎 严重的新 氏肠杆菌） 生儿脑膜 是肠杆菌科 炎、小肠 的一种， 结肠炎和 1980年由黄 茵血症， 色阴沟肠杆 死亡率高 菌更名为阪 达50% 崎肠杆菌。 以上。
②分离
各取增菌培养物1 环，分 别划线接种于两个阪崎肠 杆菌显色培养基平板
挑取1 个～5 个可疑菌落，划 线接种于TSA 平板。 25 ℃±1 ℃培养48 h±4 h。
③鉴定
自TSA 平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。阪崎肠杆菌的主 要生化特征见表1。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。
刚分离的阪崎肠杆菌在结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂上生长 形成两种不同的菌落：一种菌落呈干燥或粘液状，边缘不规 则，用接种环挑动，菌落具有明显的附着感并且有弹性；另 一种菌落则很光滑，很容易用接种环挑取，并发现该菌在肉 汤培养基中生长呈现团块或沉淀状，但目前还不清楚菌落特 征差别是否与毒性有关。
阪崎肠杆菌的生理生化特征
• ④结果与报告
• 综合菌落形态和生化特征，报告每100 g（mL）样品中检出 或未检出阪崎肠杆菌。
阪崎肠杆菌检验 GB/T 4789.40-2010
①样品的稀释
样品各三份
第二法 阪崎肠杆菌的计 数 ②分离 （同第一法） ③鉴定
100g
10g
1g
已预热到 44℃的蛋 白胨稀释 900ml 90ml 9ml 剂 置36 ℃±1 ℃培养18 h±2 h。
培养基和试剂
培养基和试剂
3、阪崎肠杆菌显色培养基DFI
坂崎肠杆菌检验详解演示文稿
第一部分：一般特征
一．命名
二． 培养特征 三． 生化反应 四． 抵抗力 五． 增殖能力
六． 致病性
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一、命名
1980年之前一直被称为黄色阴沟肠杆菌。 • DNA-DNA杂交 • 生化反应
• 黄色素 • 抗生素敏感性
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第6页，共31页。
二、培养特征
– 上述方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准 采用。
• 在肠杆菌的生化鉴定中使用最广泛的是API 20E和 Vitek GNI+。
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第29页，共31页。
API 20E生化鉴定板典型生化反应图示
API 20E反应编码 3345 373 3305 173 3305 363 3305 373
• G－无芽孢杆菌，兼性厌氧，在6℃-47℃范围 内均可生长，适温35-37℃
• 营养要求不高： VRBGA、TSA、NA、MAC、EMB、其他
与其他常见肠杆菌相似
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第7页，共31页。
三、生化反应
生化反应 D-山梨醇 产生吐温80脂酶 细胞外Dnase 氧化酶试验 黄色菌落 α-葡萄糖苷酶
2. 美国FDA 2002年颁布的“婴儿配方粉中阪崎肠杆菌的分离和计 数”（Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula）方法；
3. 2004年荷兰乳及乳制品控制中心对各种阪崎肠杆菌检测方法的比较 研究；
2. FDA July 2002; Revised August 2002
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第一法 阪崎肠杆菌的检验
阪崎肠杆菌检验程序
检样 10010g0（g（mmLL））+BPW稀释液 900 mL
36℃±1℃，18 h±2h
1mL + mLST-Vm 10mL 44℃±0.5℃，24 h±2h
DFI琼脂 36℃±1℃，24 h±2h
挑取蓝绿色菌落
前增菌 选择性增菌
选择性分离
TSA 25℃±1℃，48h±4h
ES及亲缘关系较近的肠杆菌生化反应比较
生化反应1
试验
阪崎 肠杆菌
阴沟 肠杆菌
产气 肠杆菌
成团 肠杆菌
日勾维 肠杆菌
赖氨酸脱羧酶 精氨酸双水解酶 鸟氨酸脱羧酶 KCN生长 发酵:
蔗糖
－
－
＋
－
＋
＋
＋
－
－
－
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
＋
v
＋
＋
＋
＋
(＋)
＋卫矛醇－Fra bibliotek(－)
－
(－)
－
核糖醇
－
(－)
＋
－
－
棉子糖
＋
＋
＋
v
＋
D-山梨醇
3. 2004年荷兰乳及乳制品控制中心对各种阪崎肠杆菌检测方法 的比较研究；
4. 雀巢研究中心2005年环境样品中阪崎肠杆菌快速检测方法； 5. 阪崎肠杆菌快速检测培养基DFI研究资料。
• SN第一部分：分离与计数方法 第二部分：PCR方法 第三部分：荧光PCR方法
常见选择性培养基
• DFI (Oxoid, UK) • ESIA (AES, France) • R＆F（R&F Laboratories，Switzerland） • OK medium • 其他：国内阪崎肠杆菌显色培养基、CES (Merck,
1. 硫化氢指示剂可以区分ES和产生少量α-葡萄糖苷酶但H2S阳 性菌株（如普通变形杆菌）。
2. ES都可以在DFI平板上生长并产生蓝绿色菌落 3. 其他常见菌在DFI平板的菌落颜色
a. 白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏 菌、泛菌属的多种菌等
b. 黄色菌落：赫氏埃希氏菌 c. 黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种
－
＋
＋
v
－
χ-甲基-葡萄糖甙
＋
(＋)
－
－
－
D-阿拉伯糖醇
－
(－)
＋
－
＋
黄色素
＋
－
－
(＋)
－
注：＋ ：90-100％；(＋) ：75-89%； V ：25-74％；(－)：10 -24％；－ ：0-9％
第三部分
食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验
主要内容
一、制订的主要依据 二、《食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验》
• ESIA:蓝色，1-3mm
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选择性增菌肉汤的选择
• FDA方法选择EE肉汤，ISO方法选择mLST-Vm ，即在LST中加入Nacl和Vm。本标准使用 mLST-Vm。
• EE肉汤适合所有肠道菌群的生长繁殖，这就可能 对ES的生长产生竞争性抑制作用，降低检出率。
• 研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门氏菌，大 肠埃希氏菌等）相比，ES具有较高的耐渗透压能 力。加入0.5M的Nacl在保证ES良好生长的同时 ，可以有效地抑制上述其他细菌的生长。
• Vm可有效地抑制G+菌的生长。而较高的生长温 度可以进一步抑制其他细菌的生长。
二、食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验
本标准修改采用
1. ISO/TS 22964 （ 1st edition 2006-02-01 ） Milk and milk products — Detection of Enterobacter sakazakii
二、培养特征
• G－无芽孢杆菌，兼性厌氧，在6℃-47℃范 围内均可生长，适温35-37℃
• 营养要求不高： VRBGA、TSA、NA、MAC、EMB、其他
与其他常见肠杆菌相似
三、生化反应
生化反应
D-山梨醇 产生吐温80脂酶 细胞外Dnase 氧化酶试验 黄色菌落 α-葡萄糖苷酶
结果
+ + + +
挑取黄色菌落 生化鉴定 报告
生化鉴定
5.1 前增菌和增菌
加样入已预 热到44℃的
BP中
左图：未混合； 右图：混合后。
5.2 分离
DFI 36℃±1℃ 24 h±2h
黄色素
TSA： 25 ℃培养后 典型ES：黄色
阴性对照E. coli ATCC 25922：白色菌落
5.3 鉴定（生化反应）
2.ESIA和DFI的基本原理相似，二者都是根据ES能 产生α-葡萄糖苷酶，分解底物XaGlc产生有色菌 落。
3.VRBGA对ES的选择性差，ES、阴沟肠杆菌和成 团肠杆菌等多种肠道菌都可以在该平板上生长并 产生粉紫色菌落，胆汁酸沉淀形成紫色晕圈。
显色培养基的选择性较好
• DFI对ES的选择性较好，ES形成的蓝绿色特征性菌落 易于辨认，而且：
2. FDA July 2002; Revised August 2002 Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula
第一法：阪崎肠杆菌的检验 第二法：阪崎肠杆菌的计数
坂崎肠杆菌检验文稿演示
优选坂崎肠杆菌检验
Enterobacter sakazakii(ES)
内容
第一部分：一般特征 第二部分：流行病学特征 第三部分：ES的检验
第一部分：一般特征
一．命名 二．培养特征 三．生化反应 四．抵抗力 五．增殖能力 六．致病性
一、命名
1980年之前一直被称为黄色阴沟肠杆菌。 • DNA-DNA杂交 • 生化反应 • 黄色素 • 抗生素敏感性
Germany)，NA+ -MUG
显色培养基的特点
-葡萄糖苷酶活性
指示剂：
1. 5-溴-4-氯-3-吲哚-，D-吡喃葡糖甙（XGlc） 2. 4-甲基伞形酮--D-葡糖苷（-MUG） 3. 4-邻硝基苯--D-吡喃葡糖甙
选择性培养基的选择
1. FDA方法使用VRBGA，ISO 方法中使用ESIA， 本方法中我们选用DFI。
制订的主要依据
1. ISO 2006年“乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测”（Milk and milk products—Detection of Enterobacter sakazakii）方法；
2. 美国FDA 2002年颁布的“婴儿配方粉中阪崎肠杆菌的分离和 计数”（Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula）方法；