凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤
YL-60050水蛭原料检验操作规程
检验操作规程
标准曲线含量公式： ()%100×1A ×A ×C 水分样对样对-⨯=M n 矿物类含量计算公式： 5.004×（B-A ）×稀释倍数×C 样 含量%= ×100% m ×1000×（1-水分） 【含量测定】 本品每1g 含抗凝血酶活性水蛭应不低于16.0U ；蚂蟥、柳叶蚂蟥应不低于3.0U 。
仪器与试剂：分析天平、离心机、数显恒温水浴锅、氯化钠等。
方法：取本品粉末（过三号筛）约1g ，精密称定，精密加入0.9%氯化钠溶液5ml ，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液100μl ，置试管（8mm ×38mm ）中，加入含0.5%（牛）纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液[注1]（临用配制）200μl ，摇匀，置水浴中（37℃±0.5℃）温浸5分钟，滴加每1ml 中含40单位的凝血酶溶液[注2]（每1分钟滴加1次，每次5μl ，边滴加边轻轻摇匀）至凝固（水蛭）或滴加每1ml 中含10单位的凝血酶溶液[注2]（每4分钟滴加1次，每次2μl ，边滴加边轻轻摇匀）至凝固（蚂蟥、柳叶蚂蟥），记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算： U=（C 1V 1/C 2V 2） 式中 U -- 每1g 含凝血酶活性单位，U/g ； C 1 -- 凝血酶溶液的浓度，μ/ml ； C 2 -- 供试品溶液的浓度，g/ml ； V 1 -- 消耗凝血酶溶液的体积，μl ； V 2 -- 供试品溶液的加入量，μl 。
中和一个单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位。
纤维蛋白原_凝血酶时间法用于水蛭质量控制方法的研究_苏斌
现行的水蛭质量控制标准为凝血酶滴定法［1］， 该方法需人为地判断滴定终点，但不同实验人员对 凝固终点的判断标准不同，存在较大误差，同时在滴 定的过程中，每滴加 1 滴凝血酶，就需要震摇 1 次， 前期形成的纤维蛋白原被破坏，导致滴加过量的凝 血酶才能凝固，特别是对于日本医蛭，凝血酶的滴加 量会达到原反应体系体积的一半，改变了反应体系， 导致测定结果不准确，重复性差，因此现行的水蛭质 量控制方 法 准 确 度 和 客 观 性 存 在 不 足，需 要 进 行 改进。
Ｒesearch on the method of fibrinogen － thrombin time by coagulometer for quality control oNG Zhi － bin2* ，GUO Yu － dong2 ，SONG Cheng － cheng1 ， HU Yu － chi，WANG Bi － song，JIN Jia － jin1
（ 1． School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China； 2． Beijing Institute for Drug Control，Beijing 100035，China）
2010 年版中国药典（ ChP 2010） 规定水蛭（ Hirudo） 的来源为蚂蟥（ Whitmania pigra Whitman） 、水蛭 （ Hirudo nipponica Whitman，该基源又称为日本医蛭） 和柳叶蚂蟥（ Whitmania acranulata Whitman） ，具有破 血、逐瘀、通经的功效［2］，临床上用于治疗血瘀证，现 代药理学研究表明，水蛭有较强的抗凝血、抗血栓作 用，能延长活化部分凝血酶时间（ APTT） 、凝血酶时间 （ TT） 和抑制血小板聚集等作用［3 －4］。本实验建立了 水蛭标准品和 Fibg － TT 法反应体系，以水蛭作为标 准品测定供试品的效价，并对该方法进行了实验室内 的方法学考察，结果发现，该方法重复性、准确度、中 间精密度和方法适用性均较好，效价测定结果可靠， 可用于考察不同批次水蛭的效价，为水蛭质量控制提 供依据。 1 仪器及材料 1. 1 实验仪器 ACLELTTE PＲO 全自动血凝分析 仪（ Instrumentation Laboratory Company） ，DT5 － 1 离 心机（ 北京时代北利离心机有限公司） ，pH 测试仪 （ Mettler Toledo） ，BS224S 赛多利斯天平（ 塞多利斯 科学仪器北京有限公司） 等。 1. 2 材 料 纤 维 蛋 白 原 （ 牛 血） （ 批 号 140626 － 201009） 和凝血酶（ 批号 140625 － 201310） ，购自中 国食 品 药 品 检 定 研 究 院； 0. 9% 生 理 盐 水 （ 批 号 120412403） ，石家庄四药有限公司； 三羟甲基氨基甲 烷（ 批号 20111020） ，国药集团化学试剂有限公司； 浓盐酸（ 批号 20120210） ，北京现代东方精细化学品 有限公司； 脉血康胶囊 （ 批号 20120502、20120403、 20120404） ，贵 州 信 邦 制 药 有 限 公 司； 水 蛭 （ 批 号
海南水蛭中水蛭素的抗凝活性研究
海南水蛭中水蛭素的抗凝活性研究刘腾;符乃光;李泽友【摘要】Objective To analyze the species of Hainan leeches and the anticoagulant activity of hirudin. Methods The morphological characteristics and thin-layer chromatogram of Hainan leech were observed. Then anti-coagulant activity was measured with the method of thrombin titration. Results Hainan leeches were Hirudinaria ma-nillensis. The anticoagulant activity of Hainan Leech hirudin was 1 174.8 U/g of whole body, 6 521.7 U/g of the head and 308.6 U/g of the body. Conclusion Hainan leeches have very good anticoagulant activity, which deserve further research and development.%目的：分析海南水蛭的品种及其中水蛭素的抗凝作用。
方法观察海南水蛭的形态特征、薄层色谱图，并采用凝血酶滴定法测定其抗凝活性。
结果海南水蛭为菲牛蛭，水蛭素的抗凝活性分别为：全身1174.8 U/g、头部6521.7 U/g、身体308.6 U/g。
结论海南水蛭具有很好的抗凝血活性，值得进一步研究开发。
【期刊名称】《海南医学》【年(卷),期】2015(000)016【总页数】3页(P2345-2346,2347)【关键词】海南水蛭;水蛭素;薄层色谱;凝血酶【作者】刘腾;符乃光;李泽友【作者单位】海南医学院药学院，海南海口 571199;海南医学院药学院，海南海口 571199;海南医学院药学院，海南海口 571199【正文语种】中文【中图分类】R282.74中药水蛭具有抗凝血、抗肿瘤、提高免疫力、降血脂等多种药理活性，临床上用于治疗多种疾病[1]。
凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤
凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤实验目的：凝血酶滴定法测定水蛭素活性含量实验仪器和试剂:电子天平 酸度计 离心机 移液器 ４5度试管架 三羟甲基氨基甲烷（Tris ） 盐酸（Hcl) 生理盐水 蒸馏水 凝血酶 纤维蛋白原及常用玻璃仪器实验步骤：１、称取1.2１g 三羟甲基氨基甲烷加蒸馏水充分溶解,定溶到50ml,浓度为０.２mol/L 。
2、用移液器取４29ul 盐酸加蒸馏水充分溶解,定溶到５０ml ，浓度为0.1ml/Ｌ。
３、从1去25ｍl,从2取４0ｍl 混合调ＰＨ到７.4（用1或2调)，加蒸馏水定溶到10０ml 。
4、称取样品1g 放入试管加生理盐水5ｍl 充分溶解30分钟。
5、把4放入离心机离心10分钟,4000转/分。
6、取3(Ｔri ｓ缓冲液)１.6ｍl,稀释纤维蛋白原0.00８g,浓度0．5%。
7、用生理盐水配制40u/ml 的凝血酶溶液。
８、从5取上清液10０ul 。
９、从6取200ｕl 加入８充分摇匀后，吹一小气泡。
10、从７每分钟取5ul 加入9迅速摇匀后，匀速转动试管,观察反应,溶液上的小气泡随液面转动时视为反应的终点（记录好滴加凝血酶的次数)。
11、计算公式为:2211V C V C U其中C1=凝血酶的浓度Ｃ２=样品的浓度V１＝滴加凝血酶的体积V2=取样的体积注：1、滴加次数超过５次还不凝固的,应按一定倍数稀释样品。
2、为了提高滴定的准确度可梯度配用不同浓度的凝血酶溶液。
3、为了提高滴定的准确度同时也可在临近凝固的下一次滴加凝血酶5ｕ/次，改为４ｕ/次,3ｕ/次，2ｕ/次，１u/次。
4、如果样品是溶液，直接取样10０uｌ检测,检测步骤和计算方法不变。
5、如果样品是可溶性粉状物，加溶液溶解后,取溶液1０0uｌ检测,检测步骤和计算方法不变。
水蛭质量标准及检验操作规程
XXXXXXXXXX 有限公司原料质量标准及检验操作规程1品名：1.1中文名：水蛭1.2汉语拼音：Shuizhi2代码：3取样文件编号：4检验方法文件编号：5依据：《中国药典》（2020年版一部）6质量标准：7.1试药与试剂：乙醇、水蛭对照药材、环已烷、乙酸乙酯、盐酸、10% 硫酸乙醇溶液、0.9%氯化钠溶液、1ml中含40单位的凝血酶溶液、0.5%（牛）纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液。
7.2仪器与用具：电子天平、超声波处理器、硅胶G薄层板、紫外光灯、烘箱、马福炉、离心机、水浴锅。
7.3性状：取本品适量，自然光下目测色泽，嗅闻气味。
7.4鉴别：取本品粉末1g,加乙醇5ml，超声处理15分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。
另取水蛭对照药材1g，同法制成对照药材溶液。
照薄层色谱法（附录7）试验，吸取上述两种溶液各5卩」分别点于同一硅胶G薄层板上，以正已烷-乙酸乙酯（4: 1 ）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105C加热至斑点显色清晰。
供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；紫外光灯（365nm）下显相同的橙红色荧光斑点。
7.5检查：7.5.1水分：不得过18.0% （附录15第二法）。
7.5.2总灰分：不得过10.0% （附录17）。
7.5.3酸不溶性灰分：不得过2.0% （附录17）。
7.5.4酸碱度：取本品粉末（过三号筛）约1g,加入0.9%氯化钠溶液10ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液照pH值测定法（附录11）测定，应为4.5~6.5。
7.5.5重金属及有害元素照铅、镉、砷、汞、铜测定法（附录35原子吸收分光光度法或电感耦合等离子体质谱法）测定，铅不得过十万分之一；镉不得过百万分之一；砷不得过百万分之五；汞不得过百万分之一；7.5.6黄曲霉毒素照黄曲霉毒素测定法（附录50）测定。
取本品粉末约5g,紧密称定，加氯化钠3 g,照黄曲霉毒素测定法项下的供试品的制备方法，测定，计算，即得。
前列宁胶囊中水蛭的提取工艺
表1因素水平因素水平123浸泡时间／h61224乙醇量／倍6812醇浓度／%607590渗漉速度／（min ／mL ）351前列宁胶囊由水蛭、黄芪等多味中药组成，具有清热解毒、活血化瘀、益气补肾的功效，用于治疗慢性前列腺增生及前列腺炎，疗效显著［1］。
现代研究表明，水蛭主要成分为多肽类物质，含有抗凝血酶活性的有效成分，具有很强的抗凝和抗血栓活性，是目前已知最强的凝血酶抑制剂［2］。
为优化前列宁胶囊中水蛭的提取工艺，我们采用正交试验法对复方中主药水蛭的提取工艺进行研究，以确定水蛭的最佳提取工艺。
1仪器与试药1.1仪器Sartoious BT 25S 型电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；DFY-500型摇摆式高速中药粉碎机（浙江温岭市大海药材器械厂）；PHS-3C 型精密pH 计（上海精密科学仪器有限公司）；DZF —6050型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。
1.2试药水蛭（产地江苏，安徽德昌药业饮片有限公司，批号：20080510），经药学院中药鉴定教研室卢伟副教授鉴定为水蛭科动物蚂蝗Whitmaniapigra Whitman ；牛血纤维蛋白原（中国药品生物制品检定所，凝固物含量61%，批号：626-200207）；凝血酶（中国药品生物制品检定所，规格：580IU ／支，批号：605-0123）；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（上海楷洋生物技术有限公司，含量≥99.5%）2方法与结果水蛭中主要抗凝血成分为水蛭素和其它抗凝血成分，多为水溶性多肽，在水煎煮过程中易被破坏，故采用渗漉法提取。
2.1正交试验设计根据药典条件和文献［3-5］，以浸泡时间、乙醇用量、乙醇浓度、渗漉速度为考察因素，用抗凝血酶活性含量为评价指标，采用正交试验优选水蛭渗漉最佳条件。
因素水平设计见表1。
2.2提取方法水蛭粉末过1号筛，称取30g ，共9份，按表1条件进行正交试验提取，合并渗漉液。
2.3抗凝血酶活性的含量测定根据2010年版《中国药典》收载的凝血酶滴定法［6］测定水蛭的抗凝血酶活性。
15898430_重组水蛭素的原核表达及分离纯化
CLKQ7 R#-:S8$F4TH$=8-:UL4RP$N$-:VC4@89HP-F4L M$-:O#P 83%3292/:%,;.%3;./<;.!;$+2.=%3#;$%$->3#(#?%3#;$;<8*,3.;@#5%(&A.;B,#;.2+;*.52+
收 稿 日 期 0&%/!&(!&( 基 金 项 目 国 家 1(* 重 点 项 目 课 题 0&%*KK%&02&)广 西 科 技 开 发 项 目 桂 科 攻 %2J1&%*!0 作 者 简 介 黄 孔 威 %JJ)!男 福 建 邵 武 人 硕 士 研 究 方 向 分 子 生 物 学 B!3D$E1J*J(1J/J!NN',#3 通 信 作 者 刘 庆 友 %J/(!男 山 东 巨 野 人 博 士 研 究 员 研 究 方 向 转 基 因 动 物 B!3D$ENOE$P0&&0!%0(',#3
水蛭入药历史 悠 久!早 在 中 国 的 东 汉 及 西 方 的 培养基购自北京陆 桥 技 术 有 限 责 任 公 司(限 制 性 核
古希腊时期就有其入药的记载'水蛭中起治疗功效 酸内切酶 E5;#和 F";#&6)@QK 连接酶&胶回收
的主要成分为水蛭 素"H$>P"$-#!它 由 医 用 水 蛭 唾 液 试剂盒 均 购 自 A38:D公 司(V?D$-!;>88试 剂 盒 购 自
液"%2&)JK0#&&'00%3 5`@[ 膜"4VBM&&&%&#均 购 自 ]$EE$=#>8公司(C$9标签 蛋白 抗体"%a%&&&&#&C\5 标记的二 抗"D-?$!3#P98!%a2&&&#均 购 自 武 汉 三 鹰 生物技术有限公司'
水蛭素的提取及含量测定
表 １ 氯 化钠 溶 液诱 导 结 果
１
实验 仪 器 、 料 及 试 剂 材
本 实 验 所 用 水 蛭 购 于 山东 省 济 宁 市 ， 佳 木 斯 大 学 药 学 经 院生药学教研室主任刘娟教授鉴定 。 Ｂ Ｚ ２ 自动 双 重 纯 水 蒸 馏 仪 （ 海 之 信 仪 器 有 限 公 Ｓ一 型 上 司 ） ５ Ｌ微 量 进 样 器 （ 海 安 亭 微 量 进 样 器 厂 ） １／ 微 量 ， 上 ，０ Ｌ ￣ 进样 器 （ 海 安 亭 微 量进 样 器 厂 ） 酶示 板 。 上 ， 凝 血 酶 （ 京 生 物 制 品 研 究 所 ） 纤 维 蛋 白 原 （ 海 市 生 北 ； 上 物 制 品 研 究所 ） 双 重 蒸 馏 水 （ ； 自制 ）Ｌ一精 氨 酸 （ 京 生 物 制 ； 北 品研 究 所 ） 牛 肠 系 膜 （ 木 斯 肉 联 厂 ） 氯 化 钠 （ 析 纯 ） 生 ； 佳 ； 分 ； 理 盐 水 （ 龙 江 省 肇 东 市 华 富 药业 有 限 责 任 公 司 ） 黑 。
２ 实 验 方 法
２ １ ． 诱 导 法
表２ 氯化钠＋Ｌ 精氨酸诱导结果 （ 一 Ｕ一４ ） Ｏ
本 实 验对 活 体 的诱 导 有 两 种 方 法 ， 种 用 不 同 浓 度 的氯 一
关 键 词 ： 蛭 素 ； 生诱 导 ； 血 酶 滴 定 水 仿 凝 中 图分 类 号 ； ８ 文 献 标 识 码 ： Ｒ２ ４ Ａ 文章 编 号 ： ０ ８ １ ４ ２ １ ） ４ ０ ８ —０ １ ０ —０ ０ （ ０ Ｏ ０ — ０ ７ １
水 蛭 素 是 从 水 蛭 中 提 取 的 一 种 酸 性 多 肽 ， 临 床 上 多 用 在 于 治 疗 不 稳 定 性 心 绞 痛 （ Ａ） 急 性 心 肌 梗 死 （ ） 血 管 形 ＵＳ ， ＡＭ ， 成术 ， 血液 透 析 ， 外 循 环 ， 移 植 （ Ｒ Ｔ）弥 漫性 血 管 内 凝 体 肾 Ｃ Ｒ ， 血 （Ｉ 等病症 。 Ｄ Ｃ） 天 然 水 蛭 索 的 分 离 与 纯 化 主 要 包 括 从 活 体 水 蛭 素 和 干 水 蛭 中分 离 提 取 水 蛭 素 。 统 的 水 蛭 素 的 获 得 是 对 水 蛭 的 一 传 次性 掠夺， 本 实验 采用诱 导方 法对活 体水蛭 素 的提取 ， 而 避 免 了 传 统 方 法 对 水 蛭 的 一 次 性 掠 夺 ， 护 了 水 蛭 的 野 生 资 保 源 ， 带 动 了水 蛭 养 殖 业 的 发 展 。 内 曾 报 道 了 一 种 能 利用 又 国 水 蛭 反 复 吸 血 并 用 其 嗉 囊 消 化 液 为 原 料 ， 不 杀 死 水 蛭 又 能 既 提取批量水蛭素的方法 。 水 蛭 素 的 含 量 测 定 方 法 有 多 种 ， 生 物 底 色 法 、 血 酶 如 凝 滴 定 法 、 散 射 法 、 联 免 疫 法 吸 附测 定 法 、 位 素 标 记 示踪 光 酶 同 法 等 。 实 验 采 用 凝 血 酶 滴 定 法 ，９０ Ｍａｋ ｒｔ 道 了 本 １７ 年 ｒｗａｄ 报 凝 血 酶 滴 定 法 ， 原 理 是 根据 水 蛭 素 与 凝 血 酶 结 合 比例 为 １ 其 ： １ｍｏ／ １和 １ ５ ｇ ｇ 。 血 酶 的 国 际 单 位 ＮＩ 水 蛭 素 的 （ ｌｍｏ） ： （／ ） 凝 Ｈ， 活 性 以 抗 凝 血 酶 活 力 单 位 ＡＴＵ 表 示 ， 个 ＡＵＴ 等 于 中 和 一 个 ＮＩ 凝 血 酶 的水 蛭 索 量 。 Ｈ
水蛭素
水蛭素中文名称：水蛭素英文名称：hirudin定义：水蛭体内的一种蛋白质，含65个氨基酸残基和3对二硫键，具有高度特异的抗凝血酶活性，抑制凝血酶结合底物，故有抗凝血作用。
所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；氨基酸、多肽与蛋白质（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布百科名片水蛭素(hirudin)是水蛭（Leech）及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65—66个氨基酸组成的小分子蛋白质(多肽)。
水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。
1.作用动物试验与临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象。
此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。
与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子；而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果。
编辑本段2.应用水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。
在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。
研究还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。
它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。
水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流而增强疗效。
动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，无论急性、亚急性的毒性试验，对血压、心率、血相、出血时间和血液化学成分均不受影响，呼吸系统也没有影响，无过敏反应，一般无特异抗体发现。
半致死剂量LD50＞50mgAg，远大于治疗所用的剂量(1mgAg)。
抗凝血酶效价测定法综合考察水蛭的提取工艺_胡瑞标
表 1 提取溶剂选择结果（ n = 3，x珋± s ）
提取溶剂
提取物的抗凝血活性（ U /g）
浸膏得率（ % ）
50% 乙醇 60% 乙醇 70% 乙醇
蒸馏水 生理盐水
182． 21 ± 1． 25 203． 37 ± 1． 65 229． 42 ± 1． 84 280． 29 ± 1． 76 270． 26 ± 1． 68
参考《中国药典》2010 版水蛭含量测定项下操作。取 相当于 1g 水蛭药材的浸膏，精密称定，精密加入 0． 9% 氯 化钠溶液 5mL，充分搅拌，浸提 30min，并时时振摇，离心， 取上清液 250μL 置 1mL 容量瓶，加 0． 9% 氯化钠溶液稀释 至刻度，摇 匀，静 置。取 稀 释 液 100μL，置 试 管 中，加 入 0． 5% （ 牛） 纤维蛋白原（ 以凝固物计） 的三羟甲基氨基甲烷 盐酸缓冲液（ 临用配制，0． 2mol / L 三羟甲基氨基甲烷 25mL 与 0． 1mol / L 盐酸溶液约 40mL，加水至 100mL，调节 pH 值 至 7． 4） 200μL，摇匀，置水浴（ 37 ± 0． 5） ℃ 温浸 5min，缓缓 滴加每 1mL 中含 10 单位的凝血酶溶液（ 每 4min 滴加 1 次， 每次 2μL，边滴加边轻轻摇匀） 至凝固，记录消耗的凝血酶 溶液的体积，计算其抗凝血活性成分。计算方法如下。
Comprehensive Study on the Extraction of Hirudo by Determinating the Antithrombase Activity
水蛭素的提取及含量测定
水蛭素的提取及含量测定HEIL0NGJIANGMEDICINEANDPHARMACYAug.2010,V o1.33No.4?87?水蛭素的提取及含量测定田丽华,刘娟,刘利成(1.佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007;z.佳木斯大学生药学研究生,黑龙江佳木斯154007)关键词:水蛭素;仿生诱导;凝血酶滴定中图分类号;R284文献标识码:A文章编号:1008—0104(201O)04—0087—01水蛭素是从水蛭中提取的一种酸性多肽,在临床上多用酶的分子表面有一个富含碱性氨基酸的纤维蛋白原识别位于治疗不稳定性心绞痛(USA),急性心肌梗死(AM),血管形点(FRS).而水蛭索的C 端含有较多的酸性氨基酸,可以结成术,血液透析,体外循环,肾移植(CRRT),弥漫性血管内凝合在FRS上,阻止凝血酶与其底物血纤维蛋白原的相互作血(DIC)等病症.用,从而达到抗凝血的目的.天然水蛭索的分离与纯化主要包括从活体水蛭素和干2.2.2凝血酶滴定过程水蛭中分离提取水蛭素.传统的水蛭素的获得是对水蛭的一次性掠夺,而本实验采用诱导方法对活体水蛭素的提取,避免了传统方法对水蛭的一次性掠夺,保护了水蛭的野生资源,又带动了水蛭养殖业的发展.国内曾报道了一种能利用水蛭反复吸血并用其嗉囊消化液为原料,既不杀死水蛭又能提取批量水蛭素的方法.水蛭素的含量测定方法有多种,如生物底色法,凝血酶滴定法,光散射法,酶联免疫法吸附测定法,同位素标记示踪法等.本实验采用凝血酶滴定法,1970年Markwardt报道了凝血酶滴定法,其原理是根据水蛭素与凝血酶结合比例为1:1(mol/mo1)和1:5(g/g).凝血酶的国际单位NIH,水蛭素的活性以抗凝血酶活力单位ATU表示,一个AUT等于中和一个NIH凝血酶的水蛭索量.1实验仪器,材料及试剂本实验所用水蛭购于山东省济宁市,经佳木斯大学药学院生药学教研室主任刘娟教授鉴定.BSZ一2型自动双重纯水蒸馏仪(上海之信仪器有限公司),5L微量进样器(上海安亭微量进样器厂),10/~L微量进样器(上海安亭微量进样器厂),酶示板.凝血酶(北京生物制品研究所);纤维蛋白原(上海市生物制品研究所);双重蒸馏水(自制);L一精氨酸(北京生物制品研究所);牛肠系膜(佳木斯肉联厂);氯化钠(分析纯);生理盐水(黑龙江省肇东市华富药业有限责任公司).2实验方法2.1诱导法本实验对活体的诱导有两种方法,一种用不同浓度的氯化钠溶液组成的诱导系统,对活体水蛭进行诱导,收集水蛭唾液腺分泌物,测定水蛭素含量,比较结果.另一种是用氯化钠和L一精氨酸组成的诱导系统,对活体水蛭进行诱导,测定水蛭素含量,比较结果.2.1.1不同浓度的氯化钠溶液诱导配制浓度为0.9%的氯化钠溶液(即生理盐水),分别稀释至浓度为0.45和0.225的氯化钠溶液(即1/2生理盐水和1/4生理盐水),装入3个小试剂瓶里,用牛肠系膜封口组成诱导系统,对活体水蛭进行诱导,观察水蛭的反应,收集其唾液,分别用凝血酶滴定法进行含量测定,选择最佳诱导条件.2.1.2氯化钠加L一精氨酸诱导配制150mm的氯化钠溶液,分别装于5个小试剂瓶中,分别加人lmmol,2mmol,4mmol,6mmol的L一精氨酸,用牛肠系膜封口组成诱导系统,对活体水蛭进行诱导,观察水蛭的反应,收集其唾液,分别用凝血酶滴定法进行含量测定,选择最佳诱导条件.2.2凝血酶滴定法2.2.1凝血酶滴定法原理本实验对水蛭索的含量采用凝血酶滴定法,其原理是:凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶,在止血时起中心作用,在凝血具体方法如下:配制不同梯度(2ONIH/mL,4ONIH/mL,8ONIH/mL,100NIH/mL)的凝血酶溶液,采用逐步缩小活性范围,多次换管重滴的浓度梯度法,对水蛭索含量进行测定, 在酶示板小孔中加200p.L0.5的纤维蛋白原(0.05mol/L) Tris—HCL缓冲液(pH7.4)再加入10—1OOL水蛭素溶液,充分混均.用微量注射器吸取标准的凝血酶溶液(2ONIH单位)5L(即0.1NIH单位),若在lmin内纤维蛋白原发生凝固,即说明已经达到滴定终点.若没有发生凝固,则换取4ONIH/mL单位的凝血酶溶液进行滴定,若仍没有凝固,则逐步扩大范围直至确定活性范围.3结果表1氯化钠溶液诱导结果表2氯化钠+L一精氨酸诱导结果(U一4O)4结论通过应用仿生诱导的方法对活体水蛭进行诱导后比较发现,当诱导溶媒为不同浓度氯化钠溶液时,其最佳的提取浓度为0.9,也就是生理盐水组的提取效果较好.当诱导溶媒为氯化钠+L一精氨酸时.发现150mLNaC1加4mL一精氨酸组的效果最好,能够得到最大剂量的水蛭素.综合两种诱导溶媒发现,诱导溶媒为氯化钠+L一精氨酸的效果较好.本实验对水蛭素含量测定采用改进后的凝血酶滴定法,即逐步缩小活性范围,多次换管重滴的浓度梯度法,对水蛭分泌的唾液进行含量测定时,具有节省时间,重复性和准确度都较好的优点.(收稿日期:201O—O4—07)黑龙江省研究生创新基金科研项目,项目编号:YJSCX2OO8—063HLJ 作者简介:田丽华(196O～)女,黑龙江佳木斯人,高级实验师.。
医学蛭类与水蛭素
医学蛭类与水蛭素蛭类动物在我国俗称蚂蟥、水蛭、马鳖等，全世界有六百余种，我国也有近百种。
它们生活在淡水、潮湿的陆地以及海水里，作为暂时性体外寄生虫有的取食鱼、龟、鳖、蛙、水鸟以及像牛、马和人这样一些哺乳动物的血液，也有的取食蚯蚓、昆虫幼虫、虾、蟹和螺、蚌之类的无脊椎动物的体液、组织以致整个身体。
我国对蛭类动物的记载早在公元前2世纪汉朝初期的《尔雅》中已经出现，对水蛭的应用在《神农本草经》中记述较为详细，谓其“主逐恶血、瘀血、月闭、破血消积聚┅┅┅┅”。
医圣张仲景（168-188）的《金匮玉幽经》里所谓“下血”即是抗凝血的“破血”作用，由此可见我国早在公元2世纪便已发现水蛭的抗凝血功能了，这比西方国家利用水蛭的历史要早千年以上。
到15世纪我国明朝李时珍著的《本草纲目》中则对水蛭在内科方面的药效作了详细的说明，并列举出不少的民间处方，主要用来治疗女子月闭、跌打损伤、漏血不止以及产后血晕等症。
古籍中还记载有把饥饿的蚂蟥装入竹筒扣在洗净的皮肤上，令其吸食脓血以治疗赤白丹肿以及将蚂蟥研成干粉末与其它中药配伍治疗跌打损伤等症。
自梁代陶弘景《本草经集注》以后历代的《本草》中都认为中药用的蚂蟥是指吸哺乳动物血液的种类。
不管是水蛭、草蛭、山蛭、泥蛭，在吸牛、马和人血这一点上是共同的，而且强调“用之当以小者为佳”。
但是我国早期的文献不可能说清楚使用吸食哺乳动物血液的蚂蟥治病的道理，以致在现今的《中国药典》中仍然将不吸哺乳动物血液的宽体金线蛭（Whitmania pigra ）和尖细金线蛭（Whitmania acranulata）列为规定的种类，用作传统中药材, 谓其功能是破血通经，消积散瘀，消肿解毒和堕胎。
在第二届全国活血化瘀学术会议上，还笼统地将主要是宽体金线蛭的水蛭确定为35味活血化瘀中药之一，归属于“作用峻裂的破血药范畴”，这些都是缺乏科学依据的，也给水蛭的医药应用造成了很大的混乱。
笔者曾对我国安徽亳州、河南禹州、四川成都荷花池和湖北蕲春几个主要中药材市场销售的水蛭以及近十种水蛭中成药的原料作了调查，发现这些全都是一种不吸哺乳动物血液，终身取食螺类，主要生活在我国山东、江苏、安徽和湖北广大湖区以及长江流域及其以北各地河滩与池塘里的宽体金线蛭，全国每年消耗数以十吨计的干品，不断地捕捉大大破坏了这个物种在自然界的资源分布，同时也是与我国古代《本草》中的记载以及现代生物医药研究成果不相符的。
生物研究水蛭实验报告(3篇)
第1篇实验名称：水蛭吸血机制与抗凝血成分研究实验者：[你的姓名]学号：[你的学号]实验组号：[你的实验组号]组内编号：[你的组内编号]合作者：[合作者姓名]实验日期：[年/月/日]实验地点：[实验地点]一、前言水蛭是一种古老的环节动物，以其吸血习性而闻名。
在长期的进化过程中，水蛭发展出了一套独特的吸血机制，并产生了一系列具有抗凝血作用的生物活性物质。
本研究旨在探讨水蛭的吸血机制，并分析其抗凝血成分的活性。
二、实验目的1. 观察水蛭的吸血过程，分析其吸血机制。
2. 提取水蛭唾液中的抗凝血成分，并进行活性分析。
3. 探讨水蛭抗凝血成分在医学领域的应用前景。
三、实验材料与方法1. 实验材料- 水蛭：购自当地水蛭养殖场。
- 实验动物：小鼠。
- 实验试剂：生理盐水、抗凝血酶、凝血酶、水蛭素等。
- 实验仪器：显微镜、离心机、分光光度计等。
2. 实验方法（1）观察水蛭吸血过程：将水蛭置于装有生理盐水的培养皿中，观察其吸血行为，并记录吸血时间和吸血量。
（2）提取水蛭唾液：将水蛭置于生理盐水中，轻轻挤压其头部，收集唾液。
（3）抗凝血成分活性分析：将收集到的唾液进行离心处理，取上清液作为抗凝血成分。
（4）凝血时间测定：取一定量的抗凝血成分，加入凝血酶和生理盐水，观察凝血时间。
（5）抗凝血酶活性测定：取一定量的抗凝血成分，加入抗凝血酶和生理盐水，观察凝血时间。
四、实验结果1. 观察水蛭吸血过程：水蛭在吸血过程中，先通过头部吸附在宿主体表，然后分泌唾液，溶解血管壁，使血液流入其口腔。
吸血时间为20-30分钟，吸血量为10-20毫升。
2. 提取水蛭唾液：收集到的唾液呈淡黄色，透明，无异味。
3. 抗凝血成分活性分析：凝血时间测定结果显示，水蛭唾液中的抗凝血成分能够显著延长凝血时间，说明其具有一定的抗凝血活性。
4. 抗凝血酶活性测定：抗凝血酶活性测定结果显示，水蛭唾液中的抗凝血成分能够有效抑制抗凝血酶的活性，说明其具有一定的抗凝血酶活性。
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创作编号：
GB8878185555334563BT9125XW
创作者：凤呜大王*
凝血酶滴定法测定水蛭素活性步骤
实验目的：凝血酶滴定法测定水蛭素活性含量
实验仪器和试剂：电子天平酸度计离心机移液器45度试管架三羟甲基氨基甲烷（Tris）盐酸（Hcl）生理盐水蒸馏水凝血酶纤维蛋白原及常用玻璃仪器
实验步骤：
1、称取 1.21g三羟甲基氨基甲烷加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml，浓度为0.2mol/L。
2、用移液器取429ul盐酸加蒸馏水充分溶解，定溶到50ml，浓度为0.1ml/L。
3、从1去25ml，从2取40ml混合调PH到7.4（用1或2调），加蒸馏水定溶到100ml。
4、称取样品1g放入试管加生理盐水5ml充分溶解30分钟。
5、把4放入离心机离心10分钟，4000转/分。
6、取3（Tris缓冲液）1.6ml，稀释纤维蛋白原0.008g，浓度0.5%。
7、用生理盐水配制40u/ml的凝血酶溶液。
8、从5取上清液100ul。
9、从6取200ul 加入8充分摇匀后，吹一小气泡。
10、从7每分钟取5ul 加入9迅速摇匀后，匀速转动试管，观察反应，溶液上的小气泡随液面转动时视为反应的终点（记录好滴加凝血酶的次数）。
11、计算公式为：2
211V C V C U
其中
C 1=凝血酶的浓度
C 2=样品的浓度
V 1=滴加凝血酶的体积
V 2=取样的体积 注：
1、滴加次数超过5次还不凝固的，应按一定倍数稀释样品。
2、为了提高滴定的准确度可梯度配用不同浓度的凝血酶溶液。
3、为了提高滴定的准确度同时也可在临近凝固的下一次滴加凝血酶5u/次，改为4u/次，3u/次，2u/次，1u/次。
4、如果样品是溶液，直接取样100ul 检测，检测步骤和计算方法不变。
5、如果样品是可溶性粉状物，加溶液溶解后，取溶液100ul 检测，检测步骤和计算方法不变。
创作编号：GB8878185555334563BT9125XW
创作者： 凤呜大王*。