分子生物学实验技巧

限制性内切酶基础知识

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如果没有限制性内切酶，当今的分子生物学研究会是个什么样子？40年来，限制性内切酶这个幕后成员默默推动着许多基础生物学研究和商业化应用。限制性内切酶（又称限制酶）首先是在细菌体内发现的，但后来在部分古细菌中也发现了这种成分。通常，限制性内切酶会切割双链DNA。每个限制性内切酶会识别特定的DNA 序列，根据不同的内切酶类型，可在识别序列内或距识别序列不远的位置处切割DNA。识别序列长度通常为 4 - 8 bp，酶切之后会形成粘性末端（5′ 或3′ 突出端）和平末端（图1）。

图 1.特定限制性内切酶切割后形成的粘性或平末端（5′ 或3′ 端）示意图。

如今业内已经鉴定了大约4000 种限制性内切酶，其中超过600种可商业化供应。是一个非常有用的资源库，可查询限制性内切酶全面信息及更新信息，包括限制性内切酶的特异性、灵敏度和商业化来源等。

本页内容：

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限制性内切酶发展史

上世纪50 年代初期，许多研究团队观测到了噬菌体对于同一物种的不同细菌宿主菌株存在感染效率差异。Grasso 和Paigen 对此的描述如下：使用在一种细菌菌株（例如，大肠杆

菌C）内繁殖的噬菌体λ 感染同一种类的另一菌株（例如，大肠杆菌K），结果发现，相比于重新感染宿主菌株（大肠杆菌C），大肠杆菌K 的感染率出现明显下降。新的宿主（大肠杆菌K）似乎可以选择性抵御或“耐受”侵入的噬菌体。研究人员还发现，这一现象并没有遗传性，因为经过一轮感染后，在新菌株中生长的噬菌体还可以以正常的感染率感染该菌株。这种现象被称为“宿主控制变异”，有关其背后的机制也成为了频繁研究的领域。

直到上世纪60 年代，人们才发现宿主控制变异的机制，其与噬菌体DNA 的酶切有关，进而发现并分离出了限制性内切酶。上世纪60 年代初Werner Arber 观测发现，宿主范围的决定性遗传物质都存在于噬菌体DNA之中，而后续实验证明甲硫氨酸参与宿主的自我保护。这些发现最终催生了限制性修饰(R-M) 体系的概念，通过该体系，来自于宿主的限制性内切酶和甲基化酶共同作用，切割外来病毒（非甲基化）DNA，同时保护宿主的DNA 不受甲基化。

颇为有趣的是，大多数R-M 体系的早期研究工作围绕限制性内切酶的Type I 和Type III 基团进行，该分类方法主要依据限制性内切酶的结构和功能（参见）。然而在Kent Wilcox 和Hamilton Smith 发现第一种Type II 级限制性内切酶HindII 之前，限制性内切酶显然还未得到充分利用。HindII 能够识别特定的对称DNA 序列，按照精确的方式切割识别序列内的位点。此功能（大多数早期Type II 限制性内切酶均发现存在此功能）促使Kathleen Danna 和Daniel Nathans 使用HindII 研究猿猴空泡病毒40 DNA ，即所谓的限制性内切酶图谱。

凭借在限制性内切酶方面的开创性研究，Daniel Nathans、Hamilton Smith 和Werner Arber 共同获得1978 诺贝尔生理学或医学奖。随着DNA 连接酶的发现以及位点特异性限制性内切酶家族不断壮大，重组DNA 技术应运而生。

限制性内切酶命名规则

该命名规则综合考虑到内切酶来源的三种特性——属名、种名和菌株或血清型——组成了一个简短的名称，后面加上罗马数字，代表来自同一菌株的多个限制性内切酶。例如，HindIII 酶（或者按照早期命名规则命名为Hin d III）代表：

•“H”代表Haemophilus

•“in”代表influenzae

•“d”代表血清型d

•“III”用于区分来自于Haemophilusinfluenza血清型d的其它限制性内切酶（例如，HindII 和HindIII）。

限制性内切酶分类

根据结构的复杂程度、识别序列、切割位点位置以及辅助因子要求，限制性内切酶分为四类。表1汇总了各类内切酶的区分特点

表 1.限制性内切酶类别和特性。

由于自身特殊的特点，Type II 限制性内切酶已经成为分子克隆、法医学DNA 分析等许多研究应用最常用的限制性内切酶。这类内切酶的特殊切割方式使其得以应用在分析，而后者也是法医学研究的基础。连接酶可酶促连接DNA 末端的5′ 磷酸基和3′ 羟基，从而使得DNA可以通过限制性内切酶产生的5′ 磷酸基和3′ 羟基末端进行重排和连接—这也是重组DNA 技术的基本原理。

由于在分子生物学研究方面很有用处，Type II 限制性内切酶成为了研究最多的酶类别，其成为了最大的内切酶类别。目前经过鉴定的Type II 限制性内切酶超过3,500 种，这些酶又被进一步细分成Type IIP、IIA、IIB、IIC、IIS 等子类别——其中的Type IIP 酶可识别回文（对称）靶标序列，是最流行的商业化限制性内切酶。

识别位点和切割特异性

另一个将限制性内切酶进行分类和比较的重要方法是同裂酶和异裂酶。

•同裂酶是具有相同识别序列及相同特异性的限制性内切酶。例如，AgeI 和BshT1 可通过相同的图谱识别和切割5′-A↓CCGGT-3′。但一系列同裂酶可能在首选位点、反应条件、甲基化敏感度和星号活性方面存在差异。

•异裂酶可以识别相同的核苷酸序列，但会在不同的位点切割DNA。例如，异裂酶SmaI (5′-CCC↓GGG-3′) 和XmaI (5′-C↓CCGGG-3′)均可识别5′-CCCGGG-3′ 但切割方式不同，因而产生不同类型的末端（此时，SmaI 产生平端，而XmaI 产生5′ 突出末端）。

识别序列和切割图谱方面的不同使限制性内切酶成为极其灵活、强大的基因材料鉴定和操作工具。

参考文献

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